顧 健,王愛(ài)玲,郝玉瑜,張夢(mèng)達(dá),孫繼敏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,合肥230022)

骨髓間充干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易于獲取、在一定條件下能大量擴(kuò)增，同時(shí)自體移植不存在倫理爭(zhēng)議，也沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)且在體內(nèi)外可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)環(huán)境下，可分化為心肌樣細(xì)胞，但其機(jī)制尚不明確[3]。本實(shí)驗(yàn)將大鼠BMSCs分別用5-氮胞苷誘導(dǎo)和與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察大鼠BMSCs在不同時(shí)間段分化為心肌樣細(xì)胞的能力及表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物心肌特異性基因肌鈣蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)、縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)和心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子4(cardiac-specific transcription factor-4,GATA-4)的差別，為今后進(jìn)一步研究BMSCs分化機(jī)制以及應(yīng)用于臨床治療缺血性心臟病提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠16只，均為4周齡，質(zhì)量80～120 g。同種新生1～3 d乳鼠40只，雌雄不限，用于分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及儀器 高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(high glucose dulbecco′s modified eagle medium,H-DMEM)(杭州四季青公司提供)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS) (Hy-clone公司提供)，5-氮胞苷、0.25%胰蛋白酶、0.125%胰蛋白酶(美國(guó)Sigm公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(Invitrogen)，cTnI、Cx43、GATA-4引物[生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)依次為ASW10353/4，ASW10351/2,120421L54/5]，兔抗大鼠cTnI單克隆抗體、兔抗大鼠CX43多克隆抗體[生工生物工程(上海)有限公司]，Ⅸ70型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS TOLYO公司)，熒光顯微鏡及攝像成像系統(tǒng)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(德國(guó) Biometra T系列)、PCR電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3BMSCs及心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 無(wú)菌條件下采集雙側(cè)股骨和脛骨骨髓，用含肝素的H-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心、棄上清，加入含20% FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)液4 mL懸浮沉淀細(xì)胞，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，放入37 ℃的5%CO2孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。72 h后首次換液，每2～3日換液1次。倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞約達(dá)80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3傳代，通過(guò)不斷換液與傳代逐漸純化擴(kuò)增BMSCs，取第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

取新生1～3 d的SD乳鼠，開(kāi)胸取出心臟，將心臟剪成1 mm3大小的碎塊，再將心臟碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.125%胰蛋白酶5 mL,于37 ℃恒溫水浴下消化5 min，將消化懸液轉(zhuǎn)移至新離心管，用含20%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)液3 mL終止消化，制成細(xì)胞懸液。按上述步驟消化心肌組織4～5次，直至其消化完全。棄掉首次細(xì)胞消化懸液，收集余下細(xì)胞懸液，離心、棄上清，細(xì)胞沉淀用含20%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)液重懸，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，差速貼壁法培養(yǎng)60 min后更換新培養(yǎng)基以純化心肌細(xì)胞。此后每2～3日換液1次，并用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

1.4體外誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)觀察 本實(shí)驗(yàn)將大鼠BMSCs分別用5-氮胞苷誘導(dǎo)和與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察大鼠BMSCs在不同時(shí)間段分化為心肌樣細(xì)胞的能力及表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物。① 5-氮胞苷誘導(dǎo)組：取第三代BMSCs，消化后吹打成細(xì)胞懸液，按1×108/L接種于覆蓋有蓋玻片的6孔板，加入10 μmol/L的5-氮胞苷進(jìn)行誘導(dǎo)，2 d后換回含15%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化，每2～3日換液1次。②BMSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組：取第三代BMSCs與培養(yǎng)第3日的心肌細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量比1∶2混勻，按1×108/L接種于覆蓋有蓋玻片的6孔板，進(jìn)行共培養(yǎng)。③對(duì)照組：取第三代BMSCs接種于覆蓋有蓋玻片6孔培養(yǎng)板，密度同前，加入含15%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)。倒置顯微鏡每日觀察3組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在培養(yǎng)的第2、4、6、8、10周取6孔板中的4孔分離細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)cTnI、CX43和GATA-4基因表達(dá)情況(引物見(jiàn)表1)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的cTnI和Cx43相關(guān)蛋白的表達(dá)。

表1 RT-PCR擴(kuò)增cTnI、CX43和GATA-4所用引物

RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng);cTnI：肌鈣蛋白I；CX43:縫隙連接蛋白43; GATA-4:心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子4

2 結(jié) 果

2.1BMSCs培養(yǎng)情況 BMSCs分離后2～4 h開(kāi)始貼壁，24 h貼壁完全，細(xì)胞形態(tài)由圓形、橢圓形逐漸延伸為梭形、多角形，第3～5日細(xì)胞開(kāi)始融合，第7～9日融合可達(dá)80%。傳代細(xì)胞增殖迅速，3～5日可長(zhǎng)滿瓶底。隨著換液與傳代，BMSCs逐漸得到純化。第18～22日可得到第三代細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞多呈梭形，排列方向趨于一致(圖1，見(jiàn)封三)。

2.2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定情況 心肌細(xì)胞貼壁前為圓形或橢圓形，培養(yǎng)60 min后開(kāi)始貼壁，約24 h后貼壁完全，貼壁后細(xì)胞多呈梭形、短桿狀，部分為星形、多角形。第2～3日可出現(xiàn)節(jié)律性自發(fā)搏動(dòng)細(xì)胞，成簇細(xì)胞搏動(dòng)較明顯且搏動(dòng)頻率不一致，為60～80次/min(圖2，見(jiàn)封三)。培養(yǎng)第3日的心肌細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測(cè)可見(jiàn)有cTnI和Cx43的表達(dá)，可見(jiàn)有肌管樣結(jié)構(gòu)(圖3-1～圖3-4，見(jiàn)封三)。

2.3各組細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)變化情況 對(duì)照組：細(xì)胞形態(tài)多為梭形，均勻一致，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞呈集落或是漩渦狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第10周時(shí)部分細(xì)胞很難消化且細(xì)胞密度較大的細(xì)胞群部分崩解，未見(jiàn)有搏動(dòng)細(xì)胞。5-氮胞苷誘導(dǎo)組：5-氮胞苷誘導(dǎo)后部分細(xì)胞脫壁死亡，第7日時(shí)細(xì)胞體積變大，多呈梭形，部分成桿狀，培養(yǎng)至第4周時(shí)細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)梭形，集落樣或是漩渦狀生長(zhǎng)，到第10周時(shí)細(xì)胞部分崩解，未見(jiàn)有搏動(dòng)細(xì)胞。共培養(yǎng)組：BMSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)1～2 h后即貼壁生長(zhǎng)，BMSCs呈長(zhǎng)梭形，較心肌細(xì)胞更為細(xì)長(zhǎng)，但沒(méi)有節(jié)律性搏動(dòng)，1周后BMSCs有趨向搏動(dòng)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)，此后這些梭形細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，2周后可見(jiàn)心肌細(xì)胞周邊部分BMSCs搏動(dòng)，頻率為20～40次/min，4周后搏動(dòng)頻率為40～60次/min，此時(shí)細(xì)胞呈肌性排列,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),搏動(dòng)細(xì)胞增多，8周后可見(jiàn)部分細(xì)胞死亡，10周后搏動(dòng)細(xì)胞較前減少，死亡細(xì)胞數(shù)增加。

2.4各組RT-PCR及電泳鑒定結(jié)果 對(duì)照組：cTnI、Cx43和GATA-4mRNA未見(jiàn)有表達(dá)；5-氮胞苷誘導(dǎo)組：第2周時(shí)cTnI、Cx43和GATA-4mRNA均有表達(dá)，GATA-4 mRNA第6周達(dá)到高峰，cTnI和Cx43mRNA第8周達(dá)高峰，第8、10周未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(圖4-1)。共培養(yǎng)組：cTnI和Cx43mRNA第2～8周表達(dá)逐漸增加，第8、10周表達(dá)未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；GATA-4第6周達(dá)高峰(圖4-2)。

4-1 5-氮胞苷誘導(dǎo)組4-2 共培養(yǎng)組

圖45-氮胞苷誘導(dǎo)組與共培養(yǎng)組目的基因電泳結(jié)果Fig1為內(nèi)參GAPDH；Fig2為cTnI的基因表達(dá)；Fig3為GATA-4的基因表達(dá)；Fig4為Cx43的基因表達(dá)

2.5各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 GATA-4 mRNA在共培養(yǎng)組及5-氮胞苷誘導(dǎo)組的表達(dá)未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而共培養(yǎng)組及5-氮胞苷誘導(dǎo)組中cTnI mRNA、Cx43 mRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且共培養(yǎng)組組中cTnI mRNA、Cx43 mRNA的表達(dá)較5-氮胞苷誘導(dǎo)組強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 共培養(yǎng)組及5-氮胞苷誘導(dǎo)組GATA-4、cTnI和Cx43mRNA的表達(dá) (n=4)

3 討 論

誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的研究中，5-氮胞苷是目前比較公認(rèn)的可體外誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的藥物[4]。5-氮胞苷是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，F(xiàn)ukuda[5]首次證明5-氮胞苷可體外誘導(dǎo)成年鼠骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞有肌管形成，具有典型的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和心肌樣的動(dòng)作電位等心肌細(xì)胞特有的特征,組織學(xué)顯示cTnI和肌凝蛋白重鏈陽(yáng)性。表明BMSCs體外經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后向心肌樣細(xì)胞分化特性，但其機(jī)制尚不完全明確。近幾年研究表明，BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的過(guò)程中，體內(nèi)心肌環(huán)境或體外“心肌樣”環(huán)境比單純的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)更為重要。袁巖等[6]通過(guò)BMSCs與心肌細(xì)胞裂解液共培養(yǎng)的方法，體外模擬心肌微環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞存在α肌動(dòng)蛋白、心臟特異性cTnT、Cx43的表達(dá)。認(rèn)為體內(nèi)心肌環(huán)境因素包括細(xì)胞間的直接接觸、電機(jī)械刺激以及心肌細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子等。

基因GATA家族是一類(lèi)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，該家族目前共有6個(gè)成員:GATA1～6 是一組組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多種組織的分化和發(fā)育中起重要作用。GATA-4參與了心肌的分化和發(fā)育，其表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞標(biāo)志物β肌球蛋白重鏈、心肌肌鈣蛋白、鈉鈣離等轉(zhuǎn)錄和表達(dá)至關(guān)重要。GATA-4參與小鼠心臟發(fā)育的整個(gè)過(guò)程的表達(dá)，在心肌層中的表達(dá)一直持續(xù)至出生后[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GATA-4 mRNA在5-氮胞苷誘導(dǎo)及與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組均有表達(dá)，說(shuō)明BMSCs有向心肌細(xì)胞分化的潛能，兩組GATA-4 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能與細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)?？p隙連接是一種膜結(jié)構(gòu)，系由一系列細(xì)胞間通道構(gòu)成，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間電和化學(xué)信號(hào)的傳遞。它們由Cx組成，是心肌細(xì)胞的特征之一。Cx43是心室肌細(xì)胞的主要的Cx。cTnI是心肌細(xì)胞的特異性蛋白。肌鈣蛋白由球形亞單位TnT、TnI和TnC構(gòu)成，TnI球蛋白相互作用，肌鈣蛋白和原肌球蛋白構(gòu)型變化，則是由Ca2+與TnC結(jié)合后引起，通過(guò)一系列變化后引起粗細(xì)肌絲之間的相對(duì)滑動(dòng)，最終使心肌纖維收縮。本實(shí)驗(yàn)中BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后，RT-PCR結(jié)果提示分化后BMSCs心肌特異性基因cTnI表達(dá)為陽(yáng)性，表明誘導(dǎo)后細(xì)胞含有心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白，而心肌結(jié)構(gòu)蛋白的出現(xiàn)是心肌細(xì)胞收縮的基礎(chǔ)。5-氮胞苷誘導(dǎo)組未見(jiàn)有搏動(dòng)細(xì)胞，可能與細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境、5-氮胞苷誘導(dǎo)劑量等相關(guān)。與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組有搏動(dòng)頻率不一致的搏動(dòng)細(xì)胞出現(xiàn)，靠近心肌細(xì)胞處搏動(dòng)較明顯，在培養(yǎng)的第2～6周可見(jiàn)搏動(dòng)頻率不一的搏動(dòng)細(xì)胞增多，第8～10周搏動(dòng)細(xì)胞數(shù)有所減少，且搏動(dòng)頻率較前降低，同時(shí)細(xì)胞死亡數(shù)較前明顯增多，這可能與細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境變化等因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中cTnI、Cx43及GATA-4僅在誘導(dǎo)組細(xì)胞有表達(dá)。在一定時(shí)間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)共培養(yǎng)組上述基因的表達(dá)較5-氮胞苷誘導(dǎo)組強(qiáng)，但培養(yǎng)10周以后三者的表達(dá)未見(jiàn)有明顯差別。5-氮胞苷誘導(dǎo)組未見(jiàn)有搏動(dòng)細(xì)胞，說(shuō)明該組細(xì)胞尚不完全具備成熟心肌細(xì)胞的功能，而與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組不同時(shí)段有搏動(dòng)頻率不一的搏動(dòng)細(xì)胞，且靠近心肌細(xì)胞的細(xì)胞搏動(dòng)明顯，這可能與搏動(dòng)心肌細(xì)胞的機(jī)械刺激有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs于體外在5-氮胞苷誘導(dǎo)及與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，可被誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。誘導(dǎo)分化后的BMSCs的生長(zhǎng)及其細(xì)胞狀態(tài)的維持需要穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。心肌微環(huán)境是促進(jìn)BMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞的因素之一。誘導(dǎo)分化后的BMSCs尚不完全具備成熟心肌細(xì)胞的功能。因此，探尋適合BMSCs定向分化的最佳狀態(tài)、觀察已分化心肌樣細(xì)胞的功能、尋找BMSCs分化為功能性心肌細(xì)胞的方法、以及如何保持其長(zhǎng)期分化潛能及分化后的狀態(tài)仍需進(jìn)一步研究。

[1] Chen G,Nayan M,Duong M,etal.Marrow stromal cells for cell-based therapy:the role of antiinflammatory cytokines in cellular cardiomyoplasty[J].Ann Thorac Surg,2010,90(1):190-197.

[2] Zhu X,Du J,Liu G.The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells[J].ClinLab,2012,58(9/10):897-903.

[3] Polisetti N,Chaitanya VG,Babu PP,etal.Isolation,characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells.Vemuganti GK[J].Neurol India,2010,58(2):201-208.

[4] Ling SK,Wang R,Dai ZQ,etal.Pretreatment of rat bone marrow mesenchymal stem cells with a combination of hypergravity and 5-azacytidine enhances therapeutic efficacy for myocardial infarction[J].Biotechnol Prog,2011,27(2):473-482.

[5] Fukuda K.Molecular characterization of regenerated cardiomyocytes derived from adult mesenchymal stem cells[J].Congenit Anom Kyoto,2002,42(1):1-9.

[6] 袁巖,陳連鳳,張抒揚(yáng),等.心肌細(xì)胞裂解液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用的研究[J].中華心血管病雜志,2005,33(2):170-173.

[7] Harlan SM,Reiter RS,Sigmund CD,etal.Requirement of TCTG(G/C) Direct Repeats and Overlapping GATA Site for Maintaining the Cardiac-Specific Expression of Cardiac troponin T in Developing and Adult Mice[J].Anat Rec (Hoboken),2008,291(12):1574-1586.