于波濤，宋宗輝，范開(kāi)華，陳 華，浦志強(qiáng)，金偉華

番瀉苷是番瀉葉、大黃等瀉下藥物的主要成分，分為番瀉苷A、B、C和D[1]?？诜瑸a苷的藥物后，轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸部位被細(xì)菌分解成大黃酸蒽酮，對(duì)大腸產(chǎn)生瀉下作用。小橋恭一等從人糞便中分離出多種番瀉苷的代謝菌，其中Bifidobacteriumsp.SEN可以將番瀉苷轉(zhuǎn)化為番瀉苷元，另外一些腸內(nèi)菌株可以將番瀉苷元向大黃酸蒽酮轉(zhuǎn)化[2]。為探究番瀉苷的生物穩(wěn)定性，本試驗(yàn)以番瀉苷A和番瀉苷B的含量變化為指標(biāo)，考察番瀉苷在人工胃液、人工腸液以及在腸道細(xì)菌作用下的分解情況，為相關(guān)制劑的研制和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料和設(shè)備

1.1.1儀器 HP 1100高效液相色譜儀(G1311A Quat Pump泵，G1315A DAD 紫外檢測(cè)器，Phenomenex Gemini C18分析柱，美國(guó) Agilent公司)；PYX-DHS-40×50-S-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠。

1.1.2試劑及藥品 番瀉苷A對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：F-002-130106，HPLC≥98%，CAS：81-27-6)，番瀉苷B對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：F-003-131001，HPLC≥98%，CAS：128-57-4)；胃蛋白酶(Biosharp公司，活性成分含量：1∶3000單位，)，胰蛋白酶(Biosharp公司，活性成分含量：1∶250單位)；營(yíng)養(yǎng)肉湯(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20120702)。

1.2方法

1.2.1溶液配制 (1)番瀉苷A與B儲(chǔ)備液:分別精密稱取番瀉苷A和番瀉苷B對(duì)照品6.82 mg、6.52 mg，用0.1%碳酸氫鈉溶液溶解并分別稀釋定容至50 ml 容量瓶中，得濃度分別為 136.4 μg/ml和130.4 μg/ml的番瀉苷A和番瀉苷B儲(chǔ)備液。(2)人工胃液[3]:取稀鹽酸16.4 ml，加水約800 ml與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1000 ml。(3)人工腸液[3]:取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 ml使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另取胰酶10 g，加適量水溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000 ml。(4)厭氧培養(yǎng)液[4]:取A液(0.78%磷酸氫二鉀)375 ml和B液(0.47%磷酸二氫鉀，1.18%氯化鈉，1.2%硫酸銨，0.12%氯化鈣，0.25%硫酸鎂)375 ml混勻，再加入5 g L-半胱氨酸，20 ml 25% L-抗壞血酸，500 ml 8%碳酸鈉，營(yíng)養(yǎng)肉湯10 g，調(diào)pH值為7.5～8.0，最后分裝于玻璃瓶中并消毒滅菌。

1.2.2色譜條件 分析柱為Phenomenex Gemini C18(4.6 mm ID× 250 mm，5 μm)，預(yù)柱:YWG-ODS(4.6 mm ×10 mm，10 μm)；流動(dòng)相：乙腈-2.7%冰醋酸溶液(18∶82)；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=270 nm。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取1.2.1項(xiàng)不同體積番瀉苷A儲(chǔ)備液，并用蒸餾水稀釋定容，得濃度分別為 2.955、5.91、11.82、23.64、47.28、59.1 μg/ml的系列番瀉苷A對(duì)照品溶液；番瀉苷B同法操作，得濃度分別為1.304、2.608、5.216、10.432、20.864、52.16 μg/ml的系列番瀉苷B對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取10 μl進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積對(duì)藥物濃度進(jìn)行回歸分析，回歸方程分別為:YA=-0.8596+6.2656C(r= 0.9999)，表明番瀉苷A在2.955～59.1 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；YB=-1.0661+5.8023C(r=0.9999)，表明番瀉苷B在1.304～52.16 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.2.3項(xiàng)下低、中、高濃度分別為2.955、23.64和59.1 μg/ml的番瀉苷A和濃度為1.304、20.864和52.16 μg/ml的番瀉苷B對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣各10 μl，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積，計(jì)算番瀉苷A的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.3724%、1.5741%和2.4738%(n=5)，番瀉苷B的RSD分別為0.2532%、1.5700%和2.6157%(n=5)，表明精密度良好。同法取番瀉苷A(23.64 μg/ml)與B(20.864 μg/ml)對(duì)照品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算番瀉苷A及番瀉苷B的RSD(n=5)，結(jié)果表明穩(wěn)定性滿足測(cè)定要求。

1.2.5番瀉苷A或B在人工胃液與人工腸液中的降解試驗(yàn) 精密量取5 ml番瀉苷A儲(chǔ)備液，分別加入到5 ml人工胃液和人工腸液中，混勻，分裝于安瓿中，熔封，置于37 ℃恒溫水浴鍋加熱，于0、3、5、7 h時(shí)分別取樣，微孔濾膜濾過(guò)，每次取續(xù)濾液10 μl進(jìn)樣，在上述色譜條件下，測(cè)定番瀉苷A的峰面積，以0時(shí)刻初始濃度為100%，計(jì)算不同時(shí)刻藥物相對(duì)殘留率。番瀉苷B同法操作。

1.2.6番瀉苷A或B的腸道細(xì)菌降解試驗(yàn) 取6名健康志愿者(表1)新鮮糞便，每5 g糞便加5 ml生理鹽水混勻，離心取上清液2.5 ml，與預(yù)熱至37 ℃的厭氧培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液10 ml混合制成腸菌培養(yǎng)液，再加入番瀉苷A或B 0.5 ml(濃度約為1 mg/ml，空白腸菌培養(yǎng)液不含番瀉苷，平行加生理鹽水0.5 ml)，混勻，精密移取2 ml分裝于已消毒的6個(gè)EP管內(nèi)，將EP管放入無(wú)氧袋中，充入CO2，置于37 ℃真空干燥箱內(nèi)，每隔15 min取出樣品，加入4 ml甲醇漩渦震蕩沉淀蛋白，離心，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取其續(xù)濾液進(jìn)樣10 μl，在上述色譜條件下，記錄番瀉苷A或B的峰面積，以0時(shí)刻初始濃度為100%，計(jì)算不同時(shí)刻藥物相對(duì)殘留率。

表1 6名健康志愿者性別和年齡

2 結(jié)果

2.1番瀉苷在人工胃液和人工腸液中不同時(shí)間的含量變化 在37 ℃條件下，7 h內(nèi)，番瀉苷A或B在人工胃液和人工腸液中的含量均無(wú)明顯變化(表2)，說(shuō)明番瀉苷A或B在人工胃液和人工腸液中較穩(wěn)定。

2.2腸道細(xì)菌對(duì)番瀉苷降解結(jié)果 空白腸菌培養(yǎng)液對(duì)番瀉苷A或B的測(cè)定沒(méi)有干擾，番瀉苷A和B腸菌營(yíng)養(yǎng)液HPLC色譜見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，番瀉苷A及B在腸道細(xì)菌作用下，降解50%分別需要(60±7)min和(37±6)min，且番瀉苷B降解速率明顯高于番瀉苷A(圖2)。此外，通過(guò)對(duì)番瀉苷A與B在<54歲及以上受試者平均殘留量的比較，發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(P<0.01，表3)。

表2 番瀉苷在人工胃液與人工腸液中不同時(shí)間的峰面積值(n=3)

表3 不同年齡組番瀉苷A和番瀉苷B殘留率(%)

圖1 番瀉苷A和B腸菌營(yíng)養(yǎng)液色譜圖

圖2 番瀉苷A與B不同時(shí)間腸道細(xì)菌降解殘留率

3 討論

許多中藥成分都是借助腸道細(xì)菌的作用轉(zhuǎn)化為有效成分而達(dá)到治療作用[5]，研究腸道細(xì)菌對(duì)番瀉苷代謝規(guī)律，有利于了解其在體內(nèi)的整個(gè)代謝過(guò)程，預(yù)測(cè)其藥效在體內(nèi)發(fā)揮的大致時(shí)間。由圖2可推測(cè)，隨腸道細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，番瀉苷A或B在2 h后將被腸道細(xì)菌大部分解，為番瀉苷制劑的服用方法及時(shí)間提供較科學(xué)的參考。

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，<54歲受試者腸道細(xì)菌對(duì)番瀉苷的降解轉(zhuǎn)化作用明顯優(yōu)于≥54歲人群，這主要與不同年齡者腸道厭氧菌多寡有關(guān)[6]。因此，在給予≥54歲中老年人使用番瀉苷制劑清潔腸道或治療便秘時(shí)，建議增加含雙岐菌乳制品或服用腸道細(xì)菌活菌片，有助于更好地發(fā)揮番瀉苷的功效。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Hayashi S，Yoshida A,Tanaka H,et al.Analytical studies on the active constituents in crude drugs.IV.Determination of sennosides in senna and formulations by high-performance liquid chroma-tography[J].Chem Pharm Bull,1980,28(2):406-412.

[2] 左風(fēng),嚴(yán)梅楨,周鐘鳴.腸道菌群對(duì)中藥有效成分代謝作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2002,27(8):570-571.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.二部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄85.

[4] 任曉亮,謝躍生.香加皮強(qiáng)心成分杠柳毒苷腸菌代謝研究[J].天津中醫(yī)藥,2007,24(6):515-516.

[5] 肖娟,王瑩.中藥化學(xué)成分腸道菌群代謝的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(5):247-250.

[6] 張圣潔，郭錦瑞.腸道菌群對(duì)中藥糖苷類成分脫糖基代謝的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(10)：1459-1464.