盧 豪,龐 偉,徐 婷,楊紅澎,奚用勇,黃承鈺,蔣與剛

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是腦內(nèi)含量最為豐富的蛋白之一,約占腦內(nèi)可溶性蛋白的2%。它作為一種去泛素化酶,參與泛素的再循環(huán),調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)的蛋白降解功能[1-2]。它最初是作為一種神經(jīng)元特異性蛋白被發(fā)現(xiàn)的,被命名為蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)。UCH-L1的作用主要表現(xiàn)在三個方面：(1)泛素水解酶活性:單體形式下,UCH-L1催化泛素C末端酯基和氨基的水解,通過這種途徑,UCH -L1能循環(huán)使用泛素分子,這對于細胞中蛋白的降解至關重要[3]。(2)泛素連接酶活性:二聚體形式下,UCH-L1的連接酶活性以α泛素核蛋白作為底物,以賴氨酸63為連接點形成泛素鏈,這使得底物免受蛋白酶體系統(tǒng)的降解,從而維持底物的穩(wěn)定性[4]。(3)單體穩(wěn)定效應:大量泛素單體與UCH-L1緊密連接,可阻止泛素單體在腦中的降解[5]。 在前期研究中,我們通過蛋白質(zhì)組學技術發(fā)現(xiàn)缺鋅可引起大鼠海馬UCH-L1表達下調(diào)、電壓門控陰離子通道-1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)表達上調(diào),并通過原代海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)實驗得到驗證[6-7]。因此推測,缺鋅引起的學習記憶能力損傷可能與UCH-L1水平降低[8]、VDAC1水平上升相關聯(lián)。為了深入研究UCH-L1在缺鋅致認知功能損傷中的作用機制,我們首先選用pEGFP-N1質(zhì)粒構建UCH-L1基因重組表達載體,取得陽性克隆,命名為pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒并進行鑒定,為進一步通過細胞轉(zhuǎn)染實驗探討UCH-L1在神經(jīng)退行性疾病機制中的作用奠定基礎,同時也為VDAC1的深入研究進行技術儲備。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：新生第1～3 d的Wistar乳鼠,由天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(津)2009-0001]。Trizol 試劑、瓊脂糖購自Invitrogen 公司；TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)、DNA Ligation Kit Ver.2.0、DNA Ligation Kit、BglⅡ限制酶和SalⅠ限制酶均購自大連TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞、TIANgel Midi Purification Kit購自北京天根公司；EZgeneTMEndoFree ezFlow Plasmid Miniprep Kit購自美國Biomiga公司；pEGFP-N1質(zhì)粒由軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所全軍軍事應激醫(yī)學重點實驗室劉曉華教授饋贈。

1.2引物設計 根據(jù)UCH-L1基因(GenBank NM_017237)信息添加酶切位點(BglⅡ,SalⅠ),設計擴增引物,上游引物序列：5' GCCAGATCTATGCAGCTGAAACCGATGG 3'；下游引物序列：5' ACGCGTCGACGCGGCTGCTTTGCAGAGAGC 3'。引物由大連寶生物公司合成。

1.3UCH-L1基因的擴增 用Trizol試劑提取Wistar乳鼠腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增UCH-L1基因。反應體系為：10×one step RNA PCR Buffer 5 μl,MgCl2(25 mM) 10 μl,dNTP混合物(各10 mM)5 μl,RNase抑制劑(40 U/μl)1 μl,AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl,AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl,上游引物(20 μM)1 μl,下游引物(20 μM)1 μl,上樣量1 μl,補足RNase Free dH2O至50 μl。反應條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.4pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒的構建 回收純化基因擴增產(chǎn)物,與pEGFP-N1載體分別經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ酶切,再回收純化UCH-L1基因及pEGFP-N1載體片段,經(jīng)T載體16 ℃反應30 min,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含50 μg/ml卡那霉素的LB平板,于37 ℃培養(yǎng) 12～16 h,挑取單一的菌落擴增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒由北京華大基因公司測序。

2 結(jié)果

2.1UCH-L1基因的擴增結(jié)果 提取的RNA通過RT-PCR反應及瓊脂糖電泳分離,如圖1所示獲得了預期的約700 bp片段,并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收 DNA片段。

圖1 RT-PCR擴增UCH-L1基因

2.2質(zhì)粒和目的DNA 基因片段的雙酶切結(jié)果 將目的DNA基因片段和pEGFP-N1質(zhì)粒同時進行雙酶切,電泳結(jié)果見圖2。從凝膠回收目的片段,然后進行連接反應,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,鋪板,于37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單一的菌落擴增培養(yǎng),提取質(zhì)粒進行測序分析。

圖2 pEGFP-N1質(zhì)粒和UCH-L1基因片段雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖

2.3質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果 圖3為質(zhì)粒測序結(jié)果,通過Blast搜索,證明就是我們所克隆的UCH-L1基因。結(jié)果表明,已成功構建了pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒。

圖3 pEGFP-N1-UCH-L1質(zhì)粒序列圖

3 討論

UCH-L1屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的泛素羧基端水解酶家族,分布于腦、睪丸、卵巢、腎臟、腫瘤等組織,經(jīng)由泛素相關途徑行使對細胞分化、增生和凋亡的調(diào)節(jié)功能。UCH-L1在大腦中的表達要遠遠高于睪丸、卵巢、腎臟等組織,與腦功能密切相關。UCH-L1在神經(jīng)元內(nèi)廣泛表達,已觀察到海馬神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)均有分布,以維持海馬神經(jīng)元的正常突觸結(jié)構和功能[9-10]。而且研究發(fā)現(xiàn),UCH-L1對于維持正常的突觸功能和學習記憶能力是必需的,恢復UCH-L1水平,可逆轉(zhuǎn)β淀粉樣蛋白處理的海馬腦片和阿爾茨海默病模型小鼠海馬腦片的突觸傳遞功能障礙,并且給予外源性UCH-L1可改善模型小鼠的認知功能[11-12]。在胚胎的發(fā)育中,UCH-L1已經(jīng)分布于未分化的中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)。研究表明,UCH-L1通過與單體泛素的相互作用,來調(diào)控神經(jīng)元前體細胞的形態(tài)和分化,從而證明了UCH-L1在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要地位[13]。在成熟神經(jīng)元中,UCH-L1仍然有很高的表達。

作為UPS中一種重要的酶,UCH-L1在阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生及發(fā)展中的重要作用日益受到關注,但眾多的環(huán)節(jié)與機制尚不清楚,有待于開展更深、更細致的研究。而pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒的成功構建,為轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞,促進UCH-L1的表達,進一步研究該基因在缺鋅致認知功能損傷中的作用機制提供了有力載體。

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