趙媛媛， 楊 帆， 楊小雁， 孔英俊， 康躋耀， 王明林， 張貴鋒， 蘇志國

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 泰安 271018；2. 中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室， 北京 100190)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一種基于軟電離的生物質(zhì)譜分析技術(shù)，具有高靈敏度、高準確度和高分辨率等優(yōu)點，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及材料科學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來，隨著新型基質(zhì)及樣品預(yù)處理技術(shù)的研究與應(yīng)用，MALDI-TOF MS在生物標志物檢測、蛋白質(zhì)測序、微生物鑒定等方面的應(yīng)用引起廣泛關(guān)注[1-2]。由于目標物的信號強度受其濃度、溶液中無機鹽種類和濃度以及小分子引起的“分子量歧視效應(yīng)”等因素的影響[3-5]，樣品預(yù)處理方法始終是基于MALDI-TOF MS分析技術(shù)應(yīng)用研究中的熱點。

圖1 試劑APTES(A)、KGM(B)和BDDE(C)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of reagents APTES (A), KGM (B) and BDDE (C)

文獻報道的用于MALDI-TOF MS分析的樣品預(yù)處理技術(shù)包括磁性微球技術(shù)、固相微萃取技術(shù)以及微流控技術(shù)等。趙曼等人采用間苯三甲酸銅包被磁性顆粒制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@[Cu3(btc)2]顆粒，對蛋白酶解產(chǎn)物中的多肽具有強吸附性[6]，類似方法還包括基于Fe3O4@C@Au和(Fe(3)O(4)@PDA NPs)納米顆粒等，可用于凝血酶和小分子化合物的質(zhì)譜分析前的預(yù)處理[7-8]，基于磁性微球的樣品處理過程需經(jīng)過微球收集、洗滌和點樣等過程，會降低樣品處理過程的通量?；谖⒘骺氐臉悠奉A(yù)處理技術(shù)已有報道，如將微流控芯片與電泳相結(jié)合可有效地實現(xiàn)目標物分離，并可將樣品轉(zhuǎn)移到MALDI的靶盤上，提高了檢測方法的通量[9]。有人利用芯片電泳將目標物分離后進行冷凍處理后直接將芯片置入MALDI靶盤上，但質(zhì)譜分析中樣品厚度對質(zhì)量精度影響較大，需要對常規(guī)的靶盤進行改造[10]。其它樣品預(yù)處理技術(shù)還包括基于Zip-Tip的樣品濃縮技術(shù)、基于液相色譜分離和自動點樣、膠內(nèi)酶解和提取技術(shù)等[11-12]，這些樣品預(yù)處理技術(shù)的局限性在于檢測限受液相色譜或電泳上樣量影響。近年來，基于微層析柱的樣品預(yù)處理方法研究日益增多[13-15]。毛細管層析柱內(nèi)可裝填離子交換層析介質(zhì)，用于從蛋白酶解產(chǎn)物中快速富集磷酸化多肽[16]。將親和配基直接固定到MALDI的靶盤上也可用于目標物快速富集[17]，基于親和層析的樣品處理技術(shù)可從樣品中富集出目標物并用于MALDI-TOF MS分析，如采用金屬螯合層析的毛細管柱可實現(xiàn)含磷酸化多肽的快速富集[18-19]等，但傳統(tǒng)方法所能處理的樣品量低，導(dǎo)致目標物濃度低而難以被檢測出。

本研究旨在探索一種毛細管親和層析柱的制備方法，采用表面氧化法結(jié)合氨基硅烷修飾法將氨基引入毛細管內(nèi)表面，將多糖進行環(huán)氧活化后偶聯(lián)到毛細管，再將蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)到多糖表面，制成親和層析柱，利用實際樣品對制備的毛細管親和層析柱有效性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、芥子酸(SA)、胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑購自美國Sigma試劑公司，BDDE試劑購自國藥集團，色譜純乙腈、三氟乙酸均購自美國熱電公司，魔芋葡甘聚糖(KGM)購自湖北遠成賽創(chuàng)公司；其它化學(xué)試劑均為市售分析純試劑。石英毛細管(內(nèi)徑500 μm、690 μm)購自河北銳灃光纖廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀為美國Agilent公司的HPLC1100，PDA檢測器為美國熱電公司UV6000檢測器(檢測池長5 cm)，MALDI-TOF MS為德國布魯克公司的AutoFlex III質(zhì)譜；X射線光電子能譜(XPS)為美國熱電公司的Escalab250Xi設(shè)備。

1.3 毛細管層析柱制備方法

毛細管層析柱制備過程，具體過程見圖2。

圖2 基于毛細管的親和層析柱制備過程Fig 2 Process for preparation of capillary affinity chromatographic column

1.3.1 毛細管內(nèi)表面處理方法

截取2 m石英毛細管，用玻璃注射器吸取10 mL超純水連續(xù)洗滌毛細管，注入“Piranha”溶液(體積比為7∶3的95%硫酸和雙氧水)，90℃恒溫處理1 h，用10 mL去離子水沖洗毛細管，使用氮氣連續(xù)吹脫毛細管內(nèi)壁20 min。

1.3.2 氨基衍生方法

將5 μmol/L APTES的甲苯溶液注入毛細管，在25℃放置20 min，使用10 mL甲苯洗滌毛細管，使用高純氮氣將毛細管內(nèi)壁吹干，在烘箱中100℃恒溫放置3 h。

1.3.3 KGM活化

按照文獻[20]中的方法制備平均分子量為5 kDa、10 kDa和20 kDa的KGM；取20 mg制備的KGM溶于5 mL NaOH溶液(濃度1.5 mol/L，含10 mg/mL硼氫化鈉)，加入100 μL BDDE， 25℃反應(yīng)3 h。加入等體積無水乙醇，離心后收集沉淀物，使用80%的乙醇水溶液洗滌沉淀物3次，氮氣吹干。

1.3.4 活化KGM偶聯(lián)

將活化后的KGM溶于0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3溶液，注入毛細管， 30℃反應(yīng)2 h，使用10 mL的NaHCO3-Na2CO3緩沖液(0.1 mol/L)連續(xù)沖洗毛細管。

1.3.5 蛋白質(zhì)偶聯(lián)

將2 mg/mL的胰蛋白酶溶液(0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液)注入步驟1.3.4處理后的毛細管，在25℃反應(yīng)3 h，用10 mL去離子水沖洗毛細管。

1.3.6 環(huán)氧基封閉

向毛細管內(nèi)注入1 mol/L乙醇胺溶液，37℃恒溫處理4 h，用5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH值4.0，含0.5 mol/L NaCl)連續(xù)沖洗毛細管。

1.4 分析方法

1.4.1 總氨基酸含量

將偶聯(lián)胰蛋白酶的毛細管(1 m)截成長度為3 cm毛細管放置到氨基酸水解瓶內(nèi)，加入6 mol/L的鹽酸，封口后在110℃水解16 h，氮氣吹干后使用0.05 mol/L的碳酸氫銨洗滌殘留物，吹干后加入50 μL碳酸氫鈉溶液(0.05 mol/L)?？偘被岷糠治龇椒▍⒄瘴墨I[21]。

1.4.2 活化KGM中環(huán)氧基含量測定

參照文獻[22]所述的方法，其中溶液中的KGM采用加入等體積無水乙醇后離心的方法進行分離，環(huán)氧基含量按單位質(zhì)量的KGM中環(huán)氧基物質(zhì)的量計算(mmol/g)。

1.4.3 XPS分析方法

將毛細管壓碎后采用XPS法分析斷面元素組成，XPS分析條件：使用帶單色器鋁靶X射線源，功率為225 W(工作電壓15 kV，發(fā)射電流15 mA)。污染碳(內(nèi)標)為284.8 eV；最小能量分辨率0.48 eV(Ag3d5/2)，XPS分析區(qū)域直徑15 μm；數(shù)據(jù)處理使用Avantage數(shù)據(jù)系統(tǒng)。

1.4.4 MALDI-TOF MS 分析方法

MALDI-TOF MS的脈沖氮激光(337 nm)離子解析電離源；加速電壓20 kV；激光脈沖次數(shù)100次/s；質(zhì)譜掃描范圍：m/z 5000～30000；正離子線性模式檢測。將SA溶解到70%的乙腈水溶液(v/v，含0.1% TFA)，濃度為10 mg/mL；將毛細管層析柱洗脫液直接在靶盤上點樣，自然風(fēng)干加1 μL SA溶液后風(fēng)干。質(zhì)譜分析前儀器的質(zhì)量數(shù)利用外標法，使用標準蛋白混合物進行校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基硅烷修飾前后毛細管的XPS分析結(jié)果

石英毛細管主要成分是SiO2，為了將羥基引入到毛細管內(nèi)表面，實驗首先采用Piranha溶液對毛細管內(nèi)壁進行了處理，在濃H2SO4和H2O2強氧化條件將羥基引入石英毛細管內(nèi)表面。APTES中的乙氧基可與羥基反應(yīng)，為了將氨基偶聯(lián)到毛細管內(nèi)表面，實驗采用APTES的甲苯溶液對毛細管的內(nèi)表面進行了修飾。采用XPS對APTES處理前后的毛細管(690 μm)內(nèi)表面元素組成進行了分析。

圖3 APTES修飾前(A)和修飾后(B)的石英毛細管表面XPS分析結(jié)果

圖3是APTES修飾前后毛細管內(nèi)表面XPS圖譜，修飾后毛細管表面出現(xiàn)結(jié)合能為399.4 eV的信號峰，與氨基中N1S結(jié)合能對應(yīng)；同時，毛細管表面出現(xiàn)結(jié)合能為284.8 eV的信號峰，與APTES中的C-C鍵對應(yīng)， C1s信號峰也出現(xiàn)在285.8 eV，與APTES中C-N鍵對應(yīng)，表明修飾后的毛細管上出現(xiàn)C-C鍵與C-N鍵。修飾前后的XPS圖譜表明氧化處理的毛細管經(jīng)APTES進一步修飾后可將-NH2成功地引入到毛細管內(nèi)表面。APTES修飾后的毛細管上N和C的元素組成分別為4.1%和25.3%，比例接近1∶6，表明在實驗條件下每個APTES分子中參與反應(yīng)的乙氧基數(shù)量并不相同。實驗利用類似的方法研究了APTES濃度和修飾時間對毛細管內(nèi)表面N元素含量的影響，結(jié)果表明在APTES濃度超過0.005 mol/L濃度條件，反應(yīng)時間超過20 min后對N含量影響并不顯著，APTES濃度低于0.001 mol/L條件下在10～40 min范圍內(nèi)修飾表面上N含量與反應(yīng)時間相關(guān)。

2.2 活化KGM的環(huán)氧基含量分析

經(jīng)BDDE活化后的KGM分子中環(huán)氧基團含量是影響蛋白質(zhì)偶聯(lián)量重要因素，主要受活化反應(yīng)的時間和活化溫度影響，實驗前期研究了KGM微球表面上環(huán)氧配基含量與溫度和時間之間的關(guān)系[22]，由于在反應(yīng)溫度超過50℃條件下受水解反應(yīng)影響，環(huán)氧基團含量會出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，50℃溫度較高，環(huán)氧基水解反應(yīng)快，環(huán)氧開環(huán)使環(huán)氧基含量迅速降低，在30℃或更低溫度條件下環(huán)氧基開環(huán)反應(yīng)的速率較低，環(huán)氧基含量達到峰值后緩慢降低。由于KGM微球與未交聯(lián)的KGM活化方法存在一定差異，實驗重點考察了25℃條件下反應(yīng)時間對KGM分子中環(huán)氧基團含量的影響。如圖4所示，在反應(yīng)初始階段環(huán)氧基團與KGM比例逐漸升高，反應(yīng)在15 h后環(huán)氧基含量增長緩慢。為了考察環(huán)氧反應(yīng)對后續(xù)蛋白偶聯(lián)量的影響，實驗分別制備了環(huán)氧基含量為1.1、1.9和2.8 mmol/g的活化KGM。

圖4 反應(yīng)時間對環(huán)氧基團與KGM(10 kDa)比例的影響

2.3 蛋白偶聯(lián)量分析

親和層析過程受毛細管表面上蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián)量影響。由于直接分析毛細管內(nèi)蛋白質(zhì)含量較為困難，實驗采用測定總氨基酸的方法研究胰蛋白酶偶聯(lián)量相對變化，并進一步考察了KGM分子量對偶聯(lián)量的影響。在環(huán)氧基含量為2.8 mmol/g條件下，采用20 kDa的活化KGM偶聯(lián)后毛細管內(nèi)胰蛋白酶的偶聯(lián)量為54 μg/m，當KGM平均分子量為10 kDa和5 kDa時，毛細管內(nèi)胰蛋白酶的偶聯(lián)量分別為33 μg/m和27 μg/m，表明KGM分子量越高則多糖鏈越長，可偶聯(lián)的蛋白質(zhì)分子數(shù)越多(圖5)。進一步地研究結(jié)果表明KGM(20 kDa)上環(huán)氧基團含量越高，則單位長度的毛細管上可偶聯(lián)的胰蛋白酶量越多，但當超過一定極限值后，胰蛋白酶偶聯(lián)量不再受環(huán)氧基團含量影響，其可能原因在于胰蛋白酶分子半徑較大，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)數(shù)量受蛋白質(zhì)的空間位阻影響。

圖5 KGM分子量對毛細管內(nèi)胰蛋白酶偶聯(lián)量的影響

圖6 含胰蛋白酶溶液(A)和平均分子量為5 kDa(B)和20 kDa KGM(C)偶聯(lián)胰蛋白酶層析柱處理后樣品MALDI-TOF MS圖譜

2.4 毛細管層析柱性能評價

實驗首先采用BSA為模型蛋白(0.1 mg/mL, 0.05 mol/L NH4HCO3)上樣至毛細管層析柱，在37℃條件下恒溫處理12 h后，將柱內(nèi)溶液直接點樣到MALDI靶盤上，可檢測出胰蛋白酶降解BSA后形成的多肽，證明了胰蛋白酶被成功偶聯(lián)在毛細管層析柱內(nèi)。實驗進一步采用胰蛋白酶抑制劑(10 μg/mL，0.05 mol/L Tris-HCl，pH值7.0)對固定化胰蛋白酶的毛細管層析柱(6 cm長，內(nèi)徑500 μm)分離性能進行了驗證，圖6A是原液的MALDI-TOF MS圖譜，圖6B和6C分別是采用平均分子量為5 kDa和20 kDa KGM偶聯(lián)胰蛋白酶層析柱，各上樣500 μL后洗脫液直接點樣后的MALDI-TOF MS圖譜。從圖6中離子種類和相對豐度可知，原樣中未檢測出胰蛋白酶抑制劑離子，經(jīng)毛細管層析柱處理后樣品中檢測出m/z19988.4的離子，以環(huán)氧活化后的20 kDa KGM為鏈接劑偶聯(lián)胰蛋白酶后的層析柱的親和分離效果明顯優(yōu)于5 kDa KGM，可見，提高KGM的分子量有助于增加層析柱上胰蛋白酶的偶聯(lián)量。

本研究表明采用所制備的毛細管親和層析柱可有效分離出胰蛋白酶抑制劑，基于毛細管親和層析柱的樣品預(yù)處理方法具有可行性。

參考文獻：

[1]Rodrigo M A M, Zitka O, Krizkova S, et al. MALDI-TOF MS as evolving cancer diagnostic tool: a review[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 95: 245-255.

[2]Sandrin T R, Goldstein J E, Schumaker S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review[J]. Mass Spectr Rev， 2013, 32(3): 188-217.

[3]Fuchs B, Schiller J. MALDI-TOF MS: much more than only protein analysis[J]. J Glycomics Lipidomics, 2013, 3(1): E113.

[4]Weidmann S, Mikutis G, Barylyuk K, et al. Mass discrimination in high-mass MALDI-MS[J]. J Am Soc Mass Spectr, 2013, 24(9): 1396-1404.

[5]Knochenmuss R. MALDI and related methods: a solved problem or still a mystery?[J] Mass Spectrom， 2013, 2: S0006.

[6]Zhao M, Deng C H, Zhang X M, et al. Facile synthesis of magnetic metal organic frameworks for the enrichment of low-abundance peptides for MALDI-TOF MS analysis[J]. Proteomics, 2013, 13(23-24): 3387-3392.

[7]Zhang X Y, Zhu S C, Deng C H, et al. Highly sensitive thrombin detection by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with aptamer functionalized core shell Fe3O4@C@Au magnetic microspheres[J]. Talanta, 2012, 88(15): 295-302.

[8]Ma Y R, Zhang X L, Zeng T, et al. Polydopamine-coated magnetic nanoparticles for enrichment and direct detection of small molecule pollutants coupled with MALDI-TOF-MS[J]. ACS Appl Mater Interface. 2013, 5(3): 1024-30.

[9]Kitagawa F, Otsuka K. Recent progress in microchip electrophoresis mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal, 2011, 55(4): 668-678.

[10]Nie L, Xu G B, Wang X Y, et al. Coupling microchip electrophoresis with MALDI-TOF-MS based on a freezing technique[J]. Chinese Chem Lett, 2013, 24: 491-493.

[11]Jakoby T, Berg B H J, Tholey A. Quantitative protease cleavage site profiling using tandem-mass-tag labeling and LC MALDI-TOF/TOF MS/MS analysis[J]. J Proteome Res, 2012, 11 (3): 1812-1820.

[12]Almeida A, Ferreira J A, Teixeira F, et al. Challenging the limits of detection of sialylated Thomsen Friedenreich antigens by in-gel deglycosylation and nano-LC-MALDI-TOF-MS[J]. Electrophoresis,2013, 34(16): 2337-2341.

[13]Horka M, Kubesova A, Salplachta J, et al. Capillary and gel electromigration techniques and MALDI-TOF MS-Suitable tools for identification of filamentous fungi[J]. Anal Chim Acta, 2012, 716(24): 155-162.

[14]Jensen P H, Mysling S, Hojrup P, et al. Glycopeptide enrichment for MALDI-TOF mass spectrometry analysis by hydrophilic interaction liquid chromatography solid phase extraction[J]. Method Mol Biol, 2013, 951: 131-144.

[15]Liu J, Wang F J, Lin H, et al. Monolithic capillary column based glycoproteomic reactor for high-sensitive analysis of N-glycoproteome[J]. Anal Chem, 2013, 85 (5): 2847-2852.

[16]Dong M M, Wu M H, Wang F J,et al. Coupling strong anion-exchange monolithic capillary with MALDI-TOF MS for sensitive detection of phosphopeptides in protein digest[J]. Anal Chem, 2010, 82 (7): 2907-2915.

[17]Ahmad-Tajudina A, Adler B, Ekstrom S, et al. MALDI-target integrated platform for affinity-captured protein digestion[J]. Anal Chim Acta, 2014, 807: 1-8.

[18]Dai L, Preston R, Bacica M,et al. Development of a potential high-throughput workflow to characterize sites of bioconjugation by immuno-affinity capture coupled to MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Bioconjugate Chem., 2013, 24 (1): 53-62.

[19]Zhang L Y, Wang H, Liang Z, et al. Facile preparation of monolithic immobilized metal affinity chromatography capillary columns for selective enrichment of phosphopeptides[J]. J Sep Sci, 2011, 34(16/17): 2122-2130.

[20]姚 雪，羅學(xué)剛，韓本超. 魔芋葡甘聚糖酶解過程及各種不同分子量魔芋葡甘低聚糖制備條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2011, 32(9): 97-101.

[21]王 棘，戰(zhàn)祥友，騰艷坤，等. DNFB柱前衍生化RP-HPLC法測定氨肽素的氨基酸含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2003, 20(6): 428-430.

[22]康躋耀, 張 寧, 周煒清，等. 基于魔芋葡甘聚糖微球的膠原覆層型微載體的制備研究[J]. 中國生物工程雜志，2013,33(5): 44-49.