絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是指由于絕經(jīng)后雌激素缺乏而引起的破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成之間不平衡而發(fā)生的骨質(zhì)疏松癥和骨折。國內(nèi)外有關(guān)報道顯示,在>60歲的老年女性中,骨質(zhì)疏松癥的患病率高達(dá)40%～50%,其中約30%～50%的患病女性將經(jīng)歷骨質(zhì)疏松相關(guān)的骨折,由此帶來的并發(fā)癥和巨額醫(yī)療費用已使骨質(zhì)疏松成為全球關(guān)注的熱點[1-3]。既往研究顯示,有60%～85%的骨量、50%～75%的骨代謝和25%～35%的骨質(zhì)疏松癥和骨折的發(fā)生取決于遺傳因素[4]。5,10亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一,其突變可能會導(dǎo)致絕經(jīng)后婦女骨密度的異常,發(fā)生骨質(zhì)疏松癥及骨折[5-8]。本研究采用以人群為基礎(chǔ)的病例-對照研究方法,探討MTHFR基因的功能性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(rs1801131 A1298C和rs1801133 C677T)的聯(lián)合作用與我國蘇州漢族人群絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松易感性的關(guān)系,進(jìn)一步闡明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的可能分子機(jī)制,為今后實施目標(biāo)明確的個體化防治提供理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用分層隨機(jī)抽樣的方法,收集蘇州市金閶區(qū)、相城區(qū)、吳中區(qū)有常住戶口并長期居住在抽樣點的年齡45～70歲自然絕經(jīng)婦女,排除有影響骨代謝的疾病及其他需長期治療的嚴(yán)重慢性疾病、調(diào)查前6月服用過激素類藥物及鈣制劑等影響骨代謝藥物及近6月內(nèi)有骨折史者。測量骨密度T值(為與同性別年輕人平均值進(jìn)行比較而得到),T值<-2.5SD為骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn),共收集骨質(zhì)疏松病例92例,平均(60.23±5.26)歲,骨超聲傳導(dǎo)速度(SOS)為(3793.91±80.52)m/s。同時期同地區(qū)收集正常對照組169例,年齡45～69歲,平均(58.01±5.70)歲,SOS值為(4043.69±94.10)m/s,與病例組年齡匹配。病例組和對照組均來自漢族人群。

1.2 調(diào)查方法 使用統(tǒng)一設(shè)計的調(diào)查表,分別對病例組和對照組進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,主要詢問內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、月經(jīng)史、生育史、高血壓等慢性病病史,測量身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍、血壓等,計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及腰臀比(WHR)。上述調(diào)查和采樣均獲得被調(diào)查者同意并簽署知情同意書。調(diào)查員經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)合格后,方可參加面訪調(diào)查。

1.3 實驗方法 應(yīng)用以色列Sunlight Medical Ltd公司生產(chǎn)的Omnisense 7000s型骨定量超聲儀測定橈骨遠(yuǎn)端SOS反映骨密度。采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)提取DNA。MTHFR功能性SNPs位點的基因型分析采用TaqMan方法。按下列體系加樣(5 μl體系): 0.5 μl DNA模板, 2.5 μl TaqMan?Universal PCR Master Mix、0.25 μl Forward/Reverse Primers 、0.125 μl Probe and 1.25 μl ddH2O。反應(yīng)條件:2 min 50 ℃、10 min 95 ℃, 15 s 95 ℃, 1 min 60 ℃, 40個循環(huán)。利用SDS 2.0軟件(ABI)觀察結(jié)果。每塊384孔板包括2個來自同一樣本的陽性對照和2個空白樣本的陰性對照。本研究檢測261份DNA樣本,成功率為100%,抽取5%樣本重復(fù)檢測,一致性為100%。引物和探針的序列由南京冀鰲生物技術(shù)有限公司合成,見表1。

表1 MTHFR基因SNP位點基因擴(kuò)增的引物和探針序列

1.4 統(tǒng)計分析 采用Epidata 3.0軟件雙軌錄入全部數(shù)據(jù)資料,核對無誤后供分析使用。采用統(tǒng)計軟件SAS 9.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析:χ2檢驗 、student-t檢驗用于分析人口學(xué)的基本特征;單因素及多因素Logistic回歸分析計算標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)(β)、OR值及95%CI;擬合優(yōu)度χ2檢驗用于對照組的基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗;使用PHASE 2.0軟件進(jìn)行單倍型分析;應(yīng)用廣義多因子降維法(GMDR)(GMDR軟件,version 0.7)檢測位點-位點、位點-環(huán)境之間的聯(lián)合作用。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 在對照組中,對rs1801131位點(1298A>C)基因型及rs1801133位點(677C>T)基因型的頻率進(jìn)行遺傳平衡檢驗,結(jié)果顯示實際頻數(shù)與理論頻數(shù)分布的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明該對照組人群2個位點基因型頻率分布均符合遺傳平衡法則,具有人群代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(n)

2.2 MTHFR基因與骨質(zhì)疏松的關(guān)聯(lián)性分析 調(diào)整年齡、BMI、WHR及產(chǎn)次后,MTHFR基因rs1801133(C→T)的位點變異與骨質(zhì)疏松的發(fā)生成正關(guān)聯(lián)。與野生型rs1801133 CC基因型相比,突變純合型rs1801133 TT及CT/TT型可以顯著增加骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險[調(diào)整OR=2.63,2.37;95%CI=(1.20～5.77),(1.16～4.87)]。經(jīng)1000次置換檢驗(Permutation test)方法校正后,該位點的基因型頻率分布在病例組與對照組間仍存在統(tǒng)計學(xué)差異。rs1801133 C/T的等位基因頻率在病例組和對照組中的差異具有顯著性(P=0.039)。未發(fā)現(xiàn)rs1801131的多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。見表3。

表3 MTHFR基因2個SNPs的基因型及等位基因頻率在病例組和對照組的分布

注:a調(diào)整因素為年齡、BMI、WHR及產(chǎn)次;b1000次置換檢驗

2.3 MTHFR基因2個SNPs的單倍型分析 單倍型分析結(jié)果表明,與最常見的單倍型CC相比,含野生等位基因rs1801131 A的單倍型AC可以顯著降低絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的患病風(fēng)險[調(diào)整OR=0.60;95%CI=(0.39～0.90)]。見表4。

表4 MTHFR基因2個SNPs的單倍型分析及與骨質(zhì)疏松易感性的關(guān)系

注:a多態(tài)性堿基順序為5′→3′,多態(tài)性位點順序依次為rs1801131, rs1801133;b調(diào)整P值;c調(diào)整因素為年齡、BMI、WHR及產(chǎn)次

2.4 MTHFR基因2個SNPs的聯(lián)合作用分析 將rs1801131、rs1801133依次命名為A1、A2,年齡、BMI、WHR及產(chǎn)次作為環(huán)境調(diào)整因素,應(yīng)用GMDR分析2個多態(tài)性位點的聯(lián)合作用,結(jié)果顯示模型A1A2 (rs1801131, rs1801133)為最佳模型(交叉驗證一致性10/10,P=0.0107),提示rs1801131和rs1801133位點在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中可能存在聯(lián)合作用。見表5。

3 討論

MTHFR基因位于人類染色體1p36.3,cDNA全長約2.2 kb,其編碼基因存在遺傳多態(tài)性,其中部分多態(tài)性的存在可能導(dǎo)致MTHFR mRNA表達(dá)下降或缺失,使其翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)量銳減,從而影響該酶的活性及穩(wěn)定性,不能催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸,引起血漿中5-甲基四氫葉酸的降低和同型半胱氨酸(Hcy)的堆積,使得作為甲基供體的甲硫氨酸合成障礙,最終引起DNA的低甲基化[9]。MTHFR所對應(yīng)的基因多態(tài)性位點從1995年677個位點到1998年1298個位點,前后相繼檢測出了20余個多態(tài)性位點,并且這些多態(tài)性位點突變基因型的交互作用較單獨作用更為明顯。本研究從分子流行病學(xué)角度,探討了MTHFR基因的rs1801131(1298A>C)位點及rs1801133(677C>T)位點聯(lián)合作用與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系。

表5 GMDR方法分析MTHFR基因2個SNPs聯(lián)合作用的模型

3.1 單位點分析 結(jié)果表明,rs1801133 TT和CT/TT基因型在病例組和對照組分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且經(jīng)過1000次置換檢驗后,其差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組(65.68%)相比,C等位基因頻率在病例組(56.52%)顯著降低(P<0.05)。攜帶rs1801133 TT和CT/TT基因型的個體與攜帶CC基因型者相比較,發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險分別增加了2.63和2.37倍[調(diào)整OR=2.63,2.37;95%CI=(1.20～5.77),(1.16～4.87)],提示T等位基因突變,可能是發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險因素。MTHFR C677T是一個最常見的不耐熱錯義突變,能引起酶的耐熱性及活性改變。該多態(tài)性位點存在2種等位基因,即野生型C與突變型T,其基因多態(tài)性在不同國家、同一國家不同地區(qū)、同一地區(qū)不同民族或種族中的分布有顯著性差異[10-12],其與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折易感性的研究結(jié)論也不盡相同[7,13-14]。有關(guān)MTHFR基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系,最早是由Miyao等[5]學(xué)者于2000年首次報道;隨后1項包含1748名丹麥絕經(jīng)后婦女的研究也證實了MTHFR rs1801133 TT基因型與絕經(jīng)后婦女的低骨礦鹽密度有關(guān),攜帶rs1801133 TT基因型的婦女骨折的發(fā)生率增加[6];Villadsen等[7]也有類似結(jié)果。本研究進(jìn)一步證實了蘇州地區(qū)漢族絕經(jīng)后婦女MTHFR基因C677T位點突變與骨質(zhì)疏松的發(fā)生存在相關(guān)性,并提示T等位基因可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨立危險因素。

3.2 單倍型分析 本研究中,單位點分析未發(fā)現(xiàn)rs1801131(1298A>C)位點突變與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險之間存在相關(guān)性。但在單倍型分析中,與最常見的單倍型CC相比,含野生等位基因rs1801131 A的單倍型AC可以顯著降低絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的患病風(fēng)險(P<0.05)。攜帶單倍型AC的個體與攜帶單倍型CC者相比較,發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險降低了40%[調(diào)整OR=0.60;95%CI=(0.39～0.90)]。以上結(jié)果提示,突變型rs1801131 C等位基因可能不是骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨立危險因素,但當(dāng)野生型rs1801131 A與rs1801133 C等位基因同時存在時,可能產(chǎn)生聯(lián)合作用降低絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險。

3.3 聯(lián)合作用分析 為研究MTHFR中2個多態(tài)性位點是否存在聯(lián)合作用,本研究對rs1801131(1298A>C)及rs1801133(677C>T)位點進(jìn)一步進(jìn)行了GMDR分析。結(jié)果表明,在調(diào)整了年齡、BMI、WHR及產(chǎn)次等環(huán)境因素后,模型A1A2 (rs1801131, rs1801133)為最佳模型(交叉驗證一致性10/10,P=0.0107),提示rs1801131和rs1801133位點在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中可能存在聯(lián)合作用。 A1298C點突變是MTHFR基因另外一種常見突變,位于MTHFR基因第7外顯子C端調(diào)節(jié)區(qū)域,該位點的腺苷酸突變?yōu)榘奏?導(dǎo)致酶的活性降低[15]。MTHFR A1298C基因多態(tài)與骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的關(guān)聯(lián)研究不多,研究結(jié)論也存在一定爭議[16-17]。既往研究認(rèn)為該位點多態(tài)性對酶活性的影響小于C677T多態(tài)性。有流行病學(xué)研究表明:當(dāng)研究婦女擁有相同的MTHFR 677 CC基因型時,MTHFR A1298C的 C等位基因突變也是體內(nèi)Hcy濃度升高的危險因素[18-19]。本研究中,單位點分析未發(fā)現(xiàn)rs1801131(1298A>C)位點突變與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險之間存在相關(guān)性,與既往研究結(jié)果一致。但在單倍型和GMDR分析中,rs1801131 A等位基因可能與rs1801133 C等位基因產(chǎn)生聯(lián)合作用,并可能成為絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中的保護(hù)因素。

綜上所述,MTHFR基因多態(tài)性與蘇州地區(qū)絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)病風(fēng)險存在明顯關(guān)聯(lián),攜帶rs1801133 TT和CT/TT基因型的個體較攜帶rs1801133 CC基因型的個體的發(fā)病風(fēng)險明顯增加;攜帶單倍型AC的個體與攜帶單倍型CC者相比較,發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險顯著降低;rs1801131 位點可能與rs1801133位點產(chǎn)生聯(lián)合作用,共同影響絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Seeman E, Eisman JA. Treatment of osteoporosis: why, whom, when and how to treat. The single most important consideration is the individual’s absolute risk of fracture [J]. Med J Aust, 2004, 180(6):298-303.

[2] 劉菊, 梅群超, 羅娜, 等.老年女性骨質(zhì)疏松癥患者血清骨標(biāo)志物和E2含量的變化及臨床意義[J]. 實用老年醫(yī)學(xué),2012, 26(6): 470-471, 479.

[3] 馬麗娜, 馮明, 李耘, 等. 老年骨質(zhì)疏松癥患者生命質(zhì)量與社會支持的關(guān)系[J]. 實用老年醫(yī)學(xué), 2013, 27 (8): 634-636.

[4] Ongphiphadhanakul B. Osteoporosis: the role of genetics and the environment[J]. Forum Nutr, 2007, 60:158-167.

[5] Miyao M, Morita H, Hosoi T, et al. Association of methylententrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism with bone mineral density in postmenopausal Japanese women[J]. Calcif Tissue Int, 2000, 66(3):190-194.

[6] Abrahamsen B, Madsen JS, Tofteng CL, et al. A common methylenetetrahydrofolate reductase(C677T) polymorphism is associated with low bone mineral density and increased fracture incidence after menopause:longitudinal data from the Danish osteoporosis prevention study[J]. J Bone Miner Res, 2003, 18(4):723-729.

[7] Villadsen MM, Bünger MH, Carstens M, et al. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism is associated with osteoporotic vertebral fractures, but is a weak predictor of BMD[J]. Osteoporos Int, 2005, 16(4):411-416.

[8] Hong X, Hau YH，Terwedow H, et al. Association of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and fracture risk in Chinese postmenopausal women[J]. Bone, 2007, 40(3):737-742.

[9] Homberger A, Linnebank M, Winter C, et al. Genomic structure and transcript variants of the human methylenetetrahydrofolate reductase gene[J]. Eur J Hum Genet，2000, 8(9):725-729.

[10] Schneider JA, Rees DC, Liu YT, et al. Worldwide distribution of a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation[J]. Am J Hum Genet, 1998, 62(5):1258-1260.

[11] Robien K, Ulrich CM. 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and leukemia risk: a HuGE minireview[J]. Am J Epidemiol, 2003, 157(7):571-582.

[12] 于佳梅, 王新春, 陳白賓, 等.中國5個民族亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)的研究[J].人類學(xué)學(xué)報, 1998, 17(3): 242-246.

[13] Riancho JA, Valero C, Zarrabeitia MT. MTHFR polymorphism and bone mineral density: meta-analysis of published studies[J]. Calcif Tissue Int, 2006, 79(5):289-293.

[14] J?rgensen HL, Madsen JS, Madsen B, et al. Association of a common allelic polymorphism (C677T) in the methylenetetrahydrofolate reductase gene with a reduced risk of osteoporotic fractures. A case control study in Danish post-menopausal women[J]. Calcif Tissue Int, 2002, 71(5):386-392.

[15] Weisberg I, Tran P, Christensen B, et al. A second genetic polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated with decreased enzyme activity[J]. Mol Genet Metab, 1998, 64(3):169-172.

[16] Zhu K, Beilby J, Dick IM, et al. The effects of homocysteine and MTHFR genotype on hip bone loss and fracture risk in elderly women[J]. Osteoporos Int, 2009, 20(7):1183-1191.

[17] Gjesdal CG, Vollset SE, Ueland PM, et al. Plasma total homocysteine level and bone mineral density: the Hordaland Homocysteine Study[J]. Arch Intern Med, 2006, 166(1):88-94.

[18] B?ttiger AK, Hurtig-Wennl?f A, Sj?str?m M, et al.Association of total plasma homocysteine with methylenetetrahydrofolate reductase genotypes 677C>T,1 298A>C, and 1793G>A and the corresponding haplotypes in Swedish children and adolescents[J].Int J Mol Med， 2007, 19(4): 659-665.

[19] Ulvik A, Ueland PM, Fredriksen A, et al.Functional infe-rence of the methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T and 1298A>C polymorphisms from a large-scale epidemiological study[J].Hum Genet，2007, 121(1): 57-64.