成骨細胞(OB)骨形成與破骨細胞(OC)骨吸收之間的平衡是維持骨組織不斷更新、保持骨質量的基本過程,一旦OB生成不足將直接導致骨形成減少,不能及時補充骨吸收和骨量丟失,進而引起骨質疏松癥等各種代謝性骨病[1]。1α,25-(OH)2D3對骨代謝影響具有兩重性, 既能促進骨形成,又能刺激骨吸收,其機制可能依賴于OB核內(nèi)的特異性受體以及通過跨膜信號轉導引起一些快速的生物學效應[2-3]。同時,骨組織表面覆蓋一層由OB和未礦化的Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)等骨基質構成的屏障,阻止破骨細胞活化和與礦化骨基質接觸,抑制骨吸收[4]。Col Ⅰ合成在細胞增殖期占主導地位,可增加細胞的多層形成,與細胞進一步分化關系密切,已有研究證明ColⅠmRNA在OB增殖期就開始表達,增殖晚期mRNA的表達明顯升高,且1α,25-(OH)2D3刺激可促進ColⅠmRNA表達, 進而促進OB的分化和成熟[4-5]。核心結合因子α-1(Cbfa-1)是OB分化、功能及骨形成重要的轉錄因子。Cbfa-1不僅能在非OB或成骨前體細胞上調節(jié)骨分化相關基因的表達,使其向OB分化,還能調節(jié)已分化OB的功能和其他生長因子的基因表達[6]。Cbfa-1 mRNA是被激活的OB標志性的表達基因,相關研究應用基因敲除小鼠模型, 發(fā)現(xiàn)敲除Cbfa-1基因可導致OB分化完全受阻, 使骨骼的膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨均受抑制[7-8]。因此,ColⅠ和Cbfa-1基因的表達與人各種骨代謝性疾病都有著密切的關系。本研究將通過體外培養(yǎng)新生SD乳鼠顱蓋骨的OB,在細胞和基因水平上探討 1α,25-(OH)2D3對OB增值、ColⅠ及Cbfa-1基因表達的影響,從而為臨床治療各種代謝性骨病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品); Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、HEPES、噻唑藍(MTT)、 二甲基亞砜 (DMSO) 、1α, 25-(OH)2D3(美國Sigma); 青霉素、鏈霉素(Hyclone 公司); 堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所提供);RT反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和Trizol總RNA提取試劑盒(MBI 公司產(chǎn)品); 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒與 RNA 提取試劑盒(Takara 公司)。

1.2 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(Precision Scientific公司); 分光光度計(U2200,HITACH,日本);電泳儀(Bio-Rad Power-PAC200,美國);PCR熱循環(huán)儀 (Hybaid, 美國);7500型實時熒光定量 PCR儀 (通用生物系統(tǒng)公司美國); 凝膠成像分析儀(UVP-97-0129-02, 美國)。

1.3 新生大鼠顱骨OB的培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下,取出生24 h內(nèi)新生SD乳鼠 (雌雄不限,清潔級,由湖北醫(yī)藥學院SPF級動物實驗中心提供) 的顱骨, 用含平衡鹽溶液 PBS沖洗數(shù)次, 放入0.25%的胰蛋白酶溶液中,剔除骨表面被膜及軟組織,將骨片剪成 1～3 mm3的骨粒, 棄去胰蛋白酶溶液。在0.1% 膠原酶Ⅱ、37 ℃環(huán)境下振蕩消化50 min, 收集消化液, 在4 ℃、1000 r/min 條件下離心10 min 使細胞沉淀,平衡鹽溶液 PBS洗3遍。將骨粒分散于100 ml培養(yǎng)瓶中, 加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液, CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2、100%空氣、95%濕度)靜置培養(yǎng)5 d后, 將骨粒棄去,細胞進行傳代培養(yǎng),細胞用胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打傳代。細胞傳至第3～4代后,通過細胞形態(tài)學觀察及ALP細胞化學染色鑒定所用細胞為OB。細胞計數(shù)后,用含 10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋成 4×104/ml的細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板(150 μl/孔),接種于24孔培養(yǎng)板(500 μl/孔),CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 鏡下觀察待細胞80%融合時,將含血清培養(yǎng)基吸棄,平衡鹽溶液沖洗2次, 加入含不同濃度1α, 25-(OH)2D3的無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),不同時間檢測細胞的增殖、分化、Col Ⅰ和Cbfα-1 mRNA表達。

1.4 藥物干預 1α,25-(OH)2D3溶于無水乙醇配成100 μmol/L貯存液,實驗時用無血清培養(yǎng)基分別稀釋為1、10、100 nmol/L,設置為1α, 25-(OH)2D3干預組,另設空白對照組(培養(yǎng)液中含無水乙醇10 μl),每個實驗組設6個復孔。

1.5 細胞增殖功能測定 接種于96孔培養(yǎng)板各實驗組分別干預處理細胞24、48 h和72 h吸去培養(yǎng)基,換上無血清培養(yǎng)基,每孔加入 MTT 20 μl,使其終濃度為500 mg/L,于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h, 離心吸棄上清,每孔加入 150 μl二甲基亞砜振蕩溶解沉淀, 10 min后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔492 nm 吸光度值(A)。

1.6 ALP 接種于24孔培養(yǎng)板各實驗組分別干預處理細胞24、48和72 h后,PBS沖洗2次,給每孔加入250 μl 0.1% TritonX-100、4 ℃反復凍融破碎細胞, 離心后收集上清液,按ALP試劑盒說明,采用對硝基苯磷酸二鈉基質動力學法(PNPP法)測定ALP活性,Bradford法測定細胞液蛋白濃度,ALP活性用蛋白濃度校正,結果以每克蛋白中ALP國際單位(U/g 蛋白)表示。以ALP活性表示細胞分化程度。

1.7 RT-PCR檢測成骨細胞Col Ⅰ 和Cbfa-1 mRNA表達:(1)細胞內(nèi)總RNA的提取:用4 ℃PBS緩沖液洗滌細胞3次,按照說明書提取細胞系總RNA,并測定濃度。具體方法:向每個培養(yǎng)瓶細胞中加入1 ml Trizol reagent,收集細胞,轉入1.5 ml塑料離心管中,室溫靜置5 min加入200 μl氯仿,劇烈震蕩15 s,靜置2 min后4 ℃離心15 min;吸取上清,加入500 μl異丙醇,上下顛倒幾次離心管,室溫靜置10 min后4 ℃離心10 min;棄去上清,加入1 ml 70%乙醇洗滌沉淀,4 ℃離心10 min;棄上清,干燥沉淀,加入10 μl無RNA酶的去離子水溶解沉淀,提取的總RNA -70 ℃保存。(2)總RNA的鑒定和定量:取5 μl RNA溶液,應用RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的純度和完整性。另取5 μl RNA溶液,稀釋后紫外可見分光光度計測其260 nm和280 nm波長的吸光度,A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0,所提RNA可用于RT-PCR實驗。 RT-PCR引物序列及反應條件為:(1)根據(jù)Genebank并參照文獻設計Col Ⅰ、Cbfa-1和β-actin 3對基因的引物,由上海生工生物工程公司合成。(2)反轉錄: 總反應體系為50 μl,內(nèi)含10× PCR buffer 5 μl,反轉錄產(chǎn)物1 μl,Taq酶0.25 μl,上下游引物各1 μl,補充滅菌去離子水至20 μl。(3)Col Ⅰ擴增條件: 94℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后延伸5 min后終止反應,4 ℃冷卻。(4)β-actin:95 ℃10 s變性, 50個循環(huán), 95 ℃ 5 s, 62 ℃ 30 s。(5)Cbfa-1擴增條件: 95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán)后72 ℃延伸反應增加7 min后終止反應,4 ℃冷卻。(6)擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,DNA條帶的單位面積光密度用凝膠成像儀測定,產(chǎn)物鑒定以 PCR maker 為標準,通過凝膠成像分析儀對目的基因和參照基因條帶進行像素值測定,并計算出二者比值,半定量其mRNA表達水平,各組均重復3次后進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 1α, 25-(OH)2D3對細胞增殖活性的影響 在72 h內(nèi),1、10 nmol/L組細胞增殖與時間呈正相關(r=0.998和0.999,P<0.05)。與0 nmol/L組比較,1 nmol/L組細胞A值在24、48 h和72 h,分別增加20.50%、38.77%和18.22%,差異均具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05);但10 nmol/L組與0 nmol/L組比較,A值差異無顯著性(P>0.05);同時100 nmol/L組細胞A值在干預72 h后減少19.30%,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 1α, 25-(OH)2D3對體外成骨細胞增殖的影響

注:在同一時間點,各組與0 nmol/L組比較,*P<0.05;同一濃度組內(nèi),干預72 h、48 h與24 h比較,△P<0.05

2.2 1α, 25-(OH)2D3對細胞ALP活性的影響 與0 nmol/L組比較,10、100 nmol/L組細胞ALP活性在干預24、48 h和72 h,均顯著增加(P<0.05);但1 nmol/L組細胞ALP活性與0 nmol/L組比較,差異均無統(tǒng)計學意義 (P>0.05);Pearson相關性分析顯示,干預72h后,1α, 25-(OH)2D3對細胞ALP活性的影響有劑量依賴性(r=0.969,P<0.05)。見表2。

表2 1α, 25-(OH)2D3對體外成骨細胞ALP活性的影響蛋白，n=6)

注:同一時間點,各組與0 nmol/L組比較,*P<0.05;同一濃度組內(nèi),72 h、48 h與24 h比較,△P<0.05

2.3 1α, 25-(OH)2D3對細胞Col Ⅰ基因mRNA表達的影響 0、1、10、100 nmol/L組細胞Col Ⅰ基因mRNA表達與時間呈正相關。與0 nmol/L組比較,100 nmol/L組細胞Col Ⅰ基因mRNA表達在24、48 h和72 h,分別增加85.87%、95.69%和85.93%,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);10 nmol/L組Col Ⅰ基因mRNA表達分別增加38.04%、31.55%和24.37%,差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05);但1 nmol/L組與0 nmol/L組比較,差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05);Pearson相關性分析顯示,干預72 h后,細胞Col Ⅰ基因mRNA表達呈劑量依賴性增加(r=0.985,P<0.05)。見表3。

表3 1α, 25-(OH)2D3對體外成骨細胞Col Ⅰ基因mRNA表達的影響

注:同一時間點,各組與0 nmol/L組比較,*P<0.05;同一濃度組內(nèi),72、48 h與24 h比較,△P<0.05

2.4 1α, 25-(OH)2D3對細胞Cbfa-1基因mRNA表達的影響 0 nmol/L組細胞Cbfa-1基因mRNA表達與時間呈正相關(表4)。與0 nmol/L組比較,100 nmol/L組Cbfa-1基因mRNA表達在24、48 h和72 h,分別增加116.67%、96.19%和98.29%,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);10 nmol/L組Cbfa-1基因mRNA表達分別增加61.91%、43.71%和35.04%,差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05);而1 nmol/L組與0 nmol/L組比較,差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05);Pearson相關性分析顯示,干預72 h后,1α, 25-(OH)2D3可誘導細胞Cbfa-1基因mRNA的表達,且呈劑量依賴性增加(r=0.969,P<0.05)。

表4 1α, 25-(OH)2D3對體外成骨細胞Cbfa-1基因mRNA表達的影響

注:同一時間點,各組與0 nmol/L組比較,*P<0.05;同一濃度組內(nèi),72、48 h與24 h比較,△P<0.05

3 討論

固醇類激素1α,25-(OH)2D3是人體必需維生素,可調節(jié)OB的增殖、分化,在維持體內(nèi)鈣磷代謝平衡及骨骼結構等方面有重要作用[9]。骨質疏松癥的發(fā)病機制主要與骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡被破壞,骨形成落后于骨吸收有關。OB和破骨細胞是參與骨代謝的重要細胞,共同維持骨代謝平衡[10]。OB來源于骨髓間質細胞,是骨代謝的主要功能細胞,是骨發(fā)生和骨重建的物質基礎,負責骨基質的合成、分泌和礦化。刺激OB增殖并促進其分化成熟是防治骨質疏松癥的主要方法[11],體外培養(yǎng)的OB也是進行抗骨質疏松新藥篩選和藥效學評價的重要模型[12]。相關研究已證實1α, 25-(OH)2D3可干擾OB的增殖和分化能力[13-14]。本研究結果顯示,1 nmol/L 1α, 25-(OH)2D3能顯著增加MTT的A值,刺激OB增殖,與0 nmol/L組比較,差異有統(tǒng)計學意義,但達到100 nmol/L時,出現(xiàn)OB增殖被抑制。骨形成取決于OB的數(shù)量與活性,研究結果提示低濃度1α, 25-(OH)2D3能增強OB的增殖能力,可抑制骨吸收及促進骨形成,可拮抗骨質疏松。

OB在骨形成過程中經(jīng)歷細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化、細胞凋亡4個階段[15]。ALP是OB分泌的特異性很高的酶蛋白,是OB分化成熟的重要標志。分化程度越高, 分泌礦化基質的能力越強,則ALP活性越高,反之則降低[16]。本研究結果顯示:與0 nmol/L組比較,100 nmol/L 1α, 25-(OH)2D3可顯著提高ALP活性,而1 nmol/L組ALP活性被抑制。ALP可催化分解有機磷酸釋放無機磷, 增加局部無機磷酸的濃度, 促進礦化, 所以ALP活性升高可為細胞間質含量改變做好準備, 并且是啟動礦化的必備條件[17]。ALP 活性越高, 說明前OB向成熟的OB分化地越明顯。本研究結果提示高濃度1α,25-(OH)2D3可增強OB分泌ALP而誘導細胞分化,但是1 nmol/L 1α,25-(OH)2D3有拮抗分泌礦化基質的能力。有研究發(fā)現(xiàn)OB增殖與分化呈負相關,OB分裂、增殖速度減慢常是細胞分化的結果[18],與本研究報道的結果一致。

Col Ⅰ是骨組織中OB合成分泌的的骨結構蛋白,與骨發(fā)生、骨生長及骨重建等過程密切相關,為骨礦化提供結構基礎,可作為OB成熟后功能活動的標志性產(chǎn)物[19]。Col Ⅰ mRNA在OB增殖期就表達,增殖晚期mRNA表達明顯升高從而進入基質成熟期[20]。本研究結果顯示1α,25-(OH)2D3干預組Col Ⅰ基因mRNA表達均增加并呈劑量-效應關系,本結果與相關報道基本一致[21]。Col Ⅰ含量的高低與OB骨形成能力的強弱表達一致,Col Ⅰ表達量高提示OB的骨形成能力較強,反之較弱,而過度表達又誘導OC骨吸收增強,使舊骨質中的骨鹽溶解而增加骨鈣釋放。研究結果提示高濃度1α,25-(OH)2D3可誘導Col Ⅰ基因過度表達,使細胞外基質形成、骨成熟和骨礦化的能力高于低濃度,反而不利于OB骨形成。

Cbfa-1作為第一個被識別的成骨分化關鍵性的特異性轉錄激活因子,表達于OB系早期,可與OC啟動子特異性DNA序列結合[22]。現(xiàn)已證明Cbfa-1是OB特異性表達的2個關鍵調控者,是OB分化和功能的中心調控因子,決定著OB的發(fā)生與分化,調節(jié)骨質礦化,在OB發(fā)育、分化和骨形成過程中起著至關重要的作用,可作為OB成熟后功能活動的標志性產(chǎn)物[23-24]。本研究結果顯示1α, 25-(OH)2D3干預組可誘導細胞Cbfa-1基因mRNA表達均呈劑量依賴性增加,100 nmol/L組與0 nmol/L組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有研究證實Cbfa-1基因敲除純合子小鼠完全缺乏骨組織,誘導OB分化完全受抑制,使骨骼的軟骨內(nèi)骨化成骨和膜內(nèi)骨化成骨均不能發(fā)生,骨內(nèi)無礦化中心出現(xiàn);在非OB如皮膚成纖維細胞過表達Cbfa-1,可誘導出OB特異性標志物如Col α Ⅰ、BSP和OC的表達;若誘導成熟OB中Cbfa-1高表達,可刺激OC骨吸收,可抑制OB成骨過程[25-26]。研究結果提示高濃度1α, 25-(OH)2D3可誘導Cbfa-1高表達甚至過度表達,而低濃度1α, 25-(OH)2D3可促進OB中Cbfa-1表達升高,調節(jié)骨基質沉積速率,增強OB成骨功能。

綜上所述,在本實驗濃度范圍內(nèi)1α, 25-(OH)2D3可誘導OB增殖和分化,對骨代謝產(chǎn)生影響,對OB成骨相關基因如Col Ⅰ和Cbfa-1mRNA表達的影響與細胞增殖和分化狀態(tài)有關,并呈時間和劑量依賴性,此研究結果對明確骨質疏松的發(fā)生機制及臨床治療具有一定價值。

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