蘇建榮，丁秀榮

侵襲性念珠菌感染的實驗室研究進(jìn)展

蘇建榮，丁秀榮

近年來，侵襲性念珠菌感染的流行趨勢發(fā)生了改變，致病菌種也有明顯變遷。除光滑念珠菌和克柔念珠菌外，大部分念珠菌對常用抗真菌藥物仍然敏感。隨著分子生物技術(shù)的應(yīng)用，真菌感染早期的、特異診斷水平有了明顯提高，對真菌耐藥機制的認(rèn)識也更加深入。本文就侵襲性念珠菌感染的實驗室研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

念珠菌?。涣餍袑W(xué)；實驗室；診斷；抗藥性；真菌

侵襲性真菌感染（invasive fungal infections,IFI）是指真菌侵入內(nèi)臟、血液、黏膜或表皮角質(zhì)層以下深部皮膚結(jié)構(gòu)引起的感染。80%的IFI由念珠菌引起，其中由白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌引起的感染占念珠菌血癥的97%，其余的則由12～14種較稀有的念珠菌引起[1]。在過去的20年中，念珠菌血癥的發(fā)生率增加了10倍，致病菌種也有明顯變遷[2]。提高真菌感染的早期、特異診斷水平，充分認(rèn)識其耐藥機制，成為臨床檢驗工作中急須解決的問題。

1 侵襲性念珠菌感染（invasive Candida infection,IFI）的流行趨勢

1.1 發(fā)病率和危險因素近30年來，隨著免疫功能低下患者的不斷增加，IFI呈持續(xù)增多趨勢。根據(jù)我國醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)顯示，真菌感染率由1999年的0.16%（519/324337）到2000年的0.23%（2522/ 1096461）再到2002年的0.24%（4323/1799868），呈不斷上升趨勢[3]。在美國，念珠菌血癥在醫(yī)院血流感染中位居第4，而且，與1992—1993年相比，2008—2011年由近平滑念珠菌和光滑念珠菌引起的IFI的比例分別增加了2倍和4倍[4]。歐洲的情況同樣不容樂觀，2006年，英國健康保護(hù)局公布，在英國每年大約有5000例IFI[5]。

IFI患者中，65歲以上的老年患者占83.1%[6]，無疑，人口老齡化是當(dāng)今IFI高發(fā)的一個重要社會因素。醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，也為IFI的發(fā)生提供了可乘之機。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計，90%的念珠菌血癥患者在近期使用過抗生素；80%以上有中心靜脈導(dǎo)管和腸外營養(yǎng)治療史，50%以上有外科手術(shù)史（30 d內(nèi)），10%以上有腫瘤化療史[7-9]。入住重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit,ICU）也是IFI的危險因素。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)，39.7%的IFI病例發(fā)生在ICU。預(yù)防性使用氟康唑，則是公認(rèn)的非白色念珠菌（光滑念珠菌和克柔念珠菌）感染的危險因素[5，7]。此外，器官移植、腎替代治療、機械性通氣等也與IFI相關(guān)，但其相關(guān)性不同文獻(xiàn)報道差異較大。

1.2 菌株分布引起IFI的念珠菌多達(dá)30多種。其中，白色念珠菌的感染率一直居首位。尤其在北歐和瑞士，由白色念珠菌引起的感染占IFI的60%以上。近年來，非白色念珠菌的感染率不斷升高，在某些地區(qū)甚至超過白色念珠菌的感染率，而且其菌種分布有明顯的地域性。例如，光滑念珠菌在美國感染率為18.8%～24.0%，在英國為22.7%，而在巴西僅為4.9%。近平滑念珠菌比較容易從科威特（30.6%）和西班牙（23.0%）分離到，而在北歐其感染率僅為4.4%。熱帶念珠菌在南美的感染率最高（20.9%～24.2%)，在北歐最低（4.0%）[11]。菌種分布差異在我國國內(nèi)也存在。近期一項多中心的研究顯示，由非白色念珠菌引起的血流感染中，近平滑念珠菌最常見[12]。但在南京市[13]、重慶市[14]等南方地區(qū)，熱帶念珠菌的感染率居非白色念珠菌的首位。基于這種菌種分布的差異，及時調(diào)查當(dāng)?shù)氐恼婢餍星闆r，比參照全球或全國性的報道對臨床更有指導(dǎo)價值。

1.3 耐藥性近年來，關(guān)于念珠菌耐藥的報道層出不窮。事實真的如此嗎?拉丁美洲一項多中心的研究顯示，99%以上的白色念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌對氟康唑敏感，光滑念珠菌中92.9%為劑量依賴敏感，7.1%對氟康唑耐藥[8]。在意大利和西班牙，98.6%的白色念珠菌、97.3%的近平滑念珠菌、95.5%的熱帶念珠菌和54.4%的光滑念珠菌對氟康唑敏感[15]。在中國，對氟康唑敏感的白色念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌占到94%以上，光滑念珠菌中87.8%為劑量依賴敏感，12.2%對氟康唑耐藥[12]。可見，白色念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對唑類藥物的敏感率仍很高；而光滑念珠菌的耐藥率不同報道間存在較大差異。這可能與當(dāng)?shù)胤颠虻念A(yù)防性使用情況相關(guān)，與其他念珠菌相比，光滑念珠菌在氟康唑的選擇壓力下更容易發(fā)展為耐藥菌[16]。

近年來，棘白菌素類藥物在臨床上的使用開始增多，除了近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌外，99%以上的臨床常見念珠菌可被＜2μg/ml的棘白菌素類藥物所抑制，即使對氟康唑耐藥的念珠菌及其生物膜也有較好的殺菌效果[16]。調(diào)查顯示，2001—2004年，血流來源的耐氟康唑的光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率為0.9%（1/110），2006—2010年耐藥率增長到11.1%（18/162），而且這些耐藥株均來自美國[17]。一項全球性調(diào)查顯示，血流來源的耐氟康唑的光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率北美洲為3%，歐洲為1%，拉丁美洲為0%，亞太地區(qū)為0%[18]?？梢?，隨著棘白菌素臨床應(yīng)用的增加，念珠菌對其耐藥率也隨之發(fā)生著變化。

2 IFI的分子實驗室診斷技術(shù)

IFI早期癥狀隱匿，病死率高。如何提高真菌感染的早期、特異診斷水平是目前臨床真菌學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，也是臨床檢驗中要解決的關(guān)鍵問題。近年來分子生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為真菌感染的早期診斷提供了新的思路。

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR方法是目前分子診斷中最常用的方法，可將菌種鑒定時間由傳統(tǒng)方法的24～48 h縮短到6～8 h。一項大型薈萃分析顯示，在確診或疑似IFI患者中，PCR方法檢測的陽性率為85%（78%～91%），而血培養(yǎng)方法的陽性率為38%（29%～46%）；采用實時PCR檢測念珠菌血癥的靈敏度和特異度分別為87%和100%，而平行的2種血清學(xué)方法的靈敏度和特異度分別為47.5%和82.6%以及96%和81%，均不及PCR方法[19]。

污染是臨床應(yīng)用PCR方法的主要障礙，其陽性結(jié)果無法區(qū)分是感染、污染還是定植。缺乏標(biāo)準(zhǔn)化也是PCR方法的一個重要缺陷，限制了其在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用。

2.2 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是一種以高通量為特點的檢測技術(shù)。商品化的基因芯片，如芬蘭的Prove-itTMSepsis assay，可同時鑒定34種細(xì)菌和8種真菌，而且，它既可以檢測分離株又可以直接檢測陽性血培養(yǎng)物，靈敏度和特異度分別為94.0%和98.0%[20]。Aittakorpi等[1]將該芯片的念珠菌檢測范圍擴展到了13種，經(jīng)驗證其靈敏度和特異度分別為99%和97%。Leaw等[21]設(shè)計的芯片可檢測77種真菌，其中包括44種念珠菌，該芯片的靈敏度為100%，特異度為97%。利用芯片技術(shù)不僅將菌種鑒定時間縮短到3～4h，還可以同時鑒定混合感染中的多種病原菌，無須分離培養(yǎng)，從而進(jìn)一步縮短了鑒定時間。

但是，基因芯片技術(shù)對DNA的量和純度要求較高，費用也高，所以尚未在臨床真菌檢驗中廣泛使用。但是，基因芯片技術(shù)快速、高通量和靈敏的優(yōu)勢，無疑使其具有極大的應(yīng)用前景。

2.3 焦磷酸測序技術(shù)焦磷酸測序技術(shù)是新一代DNA測序技術(shù)。該方法的重復(fù)性和精確性可與傳統(tǒng)的Sanger法相媲美，但不需要電泳，不需要對樣品標(biāo)記和染色，檢測速度大大提高。焦磷酸測序技術(shù)對念珠菌屬中的大多數(shù)致病菌可準(zhǔn)確鑒定，且可區(qū)分表型非常相近的念珠菌。Borman等[22]運用焦磷酸測序技術(shù)，從1839株白色念珠菌標(biāo)本中鑒定出15株C.africana，并明確區(qū)分出近平滑念珠菌復(fù)合體中的C.parapsilosis、C.metapsilosis和C.orthopsilosis菌種。

目前，焦磷酸測序僅能測定100 bp以內(nèi)的核酸片段，對重復(fù)序列測定準(zhǔn)確性較差，鑒定親緣關(guān)系較近的菌株可能須借助不止一對引物。

2.4 質(zhì)譜技術(shù)近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。商品化的微生物鑒定質(zhì)譜儀主要有布魯克公司的MALDI BiotyperTM和梅里埃公司的VITEK MSTM，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中有近4000種常見微生物的特征指紋圖譜，用戶還可以根據(jù)需要隨時添加。

MALDI-TOFMS對念珠菌分離株的鑒定準(zhǔn)確率為96%～100%，也可以直接鑒定陽性血培物中病原真菌，并且可區(qū)分表型和基因型非常相近的菌種[23-24]。Spanu等[25]用MALDI-TOFMS技術(shù)對340份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行檢測，對白色念珠菌和非白色念珠菌的檢測靈敏度分別為95.9%和86.5%，菌種鑒定時間縮短到30min，但該方法對同時存在多種病原體的標(biāo)本無法鑒定。

MALDI-TOFMS對微生物的鑒定是通過所獲得的質(zhì)譜圖與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配分析來實現(xiàn)的，所以對待測標(biāo)本質(zhì)譜信息有影響的因素，以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)成和質(zhì)量對其鑒定的準(zhǔn)確性有影響[26]。

3 念珠菌對常用抗真菌藥物的耐藥機制

借助分子生物技術(shù)，人們對真菌的耐藥機制有了深入的了解，特別在念珠菌對唑類藥物和棘白菌素的耐藥機制研究中取得了長足的進(jìn)步。

3.1 對唑類藥物的耐藥機制唑類藥物的作用靶位酶為14-α-去甲基酶（14-DM），它是真菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成的關(guān)鍵酶。14-DM由ERG11基因編碼。據(jù)文獻(xiàn)報道，白色念珠菌的唑類耐藥株均存在ERG11的多點突變，和（或）ERG11的過度表達(dá)；而編碼麥角甾醇合成途徑中其他酶的基因（如ERG3、ERG5、ERG24、ERG6等）的突變或過度表達(dá)也可降低白色念珠菌對唑類藥物的敏感性[27]。

多耐藥轉(zhuǎn)運蛋白也與白色念珠菌對唑類藥物耐藥密切相關(guān)。目前已知的多耐藥轉(zhuǎn)運蛋白是ABC轉(zhuǎn)運蛋白和主要易化載體超家族（MFS）。其中，編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的CDR基因中僅CDR1和CDR2與唑類藥物耐藥相關(guān)，而且，CaCDR1的高表達(dá)比CaCDR2更關(guān)鍵[28]。編碼MFS的MDR基因僅與念珠菌對氟康唑的耐藥相關(guān)，與其他唑類藥物的交叉耐藥無關(guān)；而編碼MFS的另一基因FLU1，是否與唑類藥物耐藥相關(guān)，尚待確定[29]。

在光滑念珠菌對唑類藥物的耐藥機制中起主導(dǎo)作用的是編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的CgCDR1和CgCDR2基因，其中CgCDR2的過度表達(dá)起主要作用。尚無證據(jù)表明光滑念珠菌ERG11基因突變或表達(dá)水平改變參與其對唑類藥物耐藥。

與光滑念珠菌相反，熱帶念珠菌耐藥株不僅ERG11基因的表達(dá)明顯上調(diào)，而且存在多點突變（主要是Y132F和S154F）。但編碼多耐藥轉(zhuǎn)運蛋白CDR1和MDR1的基因表達(dá)量無明顯改變[30]。

3.2 對棘白菌素的耐藥機制棘白菌素的靶位酶是位于真菌細(xì)胞壁的1,3-β-D葡聚糖合成酶，其編碼基因是FKS（FKS1和FKS2）。對棘白菌素耐藥的白色念珠菌的基因突變主要發(fā)生在FKS1的2個熱點區(qū)：氨基酸殘基641～649和殘基1345～1365。光滑念珠菌的基因突變則發(fā)生在FKS1或FKS2。據(jù)報道，美國發(fā)現(xiàn)的18株耐棘白菌素的光滑念珠菌中，9株為FKS1突變，7株為FKS2突變。而近平滑念珠菌對棘白菌素天然不敏感，因為該菌種FKS1的第660個氨基酸殘基——脯氨酸被丙氨酸所代替[16]。

目前研究較多的還有熱休克蛋白90（Hsp90）調(diào)節(jié)的念珠菌屬對棘白菌素的耐藥。Hsp90通過其客戶蛋白參與念珠菌多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，對真菌由于快速選擇而產(chǎn)生的耐藥性及這種耐藥性的維持起重要作用[31]。Hsp90最關(guān)鍵的客戶蛋白是鈣調(diào)磷酸酶，Hsp90就是通過穩(wěn)定鈣調(diào)磷酸酶的催化亞基，實現(xiàn)對白色念珠菌的棘白菌素耐受性的調(diào)節(jié)，該過程中鈣調(diào)磷酸酶的下游效應(yīng)因子Crz1也發(fā)揮了重要作用。適量的Hsp90抑制劑（格爾德霉素或赤根殼菌素），可減弱白色念珠菌對棘白菌素的耐受性，并與棘白菌素產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，這充分肯定了Hsp90在調(diào)節(jié)念珠菌屬對棘白菌素耐藥中的作用。

在研究念珠菌對棘白菌素的耐藥機制時，一個值得注意的現(xiàn)象就是矛盾生長現(xiàn)象。該現(xiàn)象是指在微量肉湯稀釋法藥物敏感性（藥敏）實驗中，某些種類的念珠菌在較低濃度的棘白菌素中被殺死，而在較高濃度的棘白菌素中持續(xù)存在時反而生長的現(xiàn)象。隨著對該現(xiàn)象研究的不斷深入，多數(shù)研究者認(rèn)為，該現(xiàn)象可能只是念珠菌的一種自我補償機制而非耐藥機制。而且，Shields等[32]發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象的發(fā)生可被健康人血清所抑制，認(rèn)為該現(xiàn)象不會在體內(nèi)發(fā)生。

3.3 藥敏影響因素須注意的是，血清、溫度和pH值等因素，會對不同抗真菌藥物的敏感性產(chǎn)生不同的影響。

3.3.1 血清人類血清對多種抗真菌藥物的藥效學(xué)有影響。如在血清存在情況下，氟康唑?qū)Π咨钪榫淖钚∫志鷿舛龋╩inimum inhibitory concentration,MIC）平均降低2個稀釋度（4倍）；而伊曲康唑和酮康唑的MIC卻明顯升高；兩性霉素B的MIC雖然不變，但其殺菌活性和后續(xù)殺菌效應(yīng)降低；米卡芬凈和阿尼芬凈對不同念珠菌的MIC也明顯升高；但卡泊芬凈受影響較小[16]。以上表明，血清對蛋白結(jié)合率高的藥物或許有降低藥效的影響，這須要提請臨床醫(yī)師注意。

3.3.2 溫度念珠菌血癥患者常伴發(fā)高熱。研究者將體外藥敏實驗的培養(yǎng)溫度提高到39℃，發(fā)現(xiàn)在此溫度下米卡芬凈顯示出比37℃時更好的殺菌效果[33]。如果這方面的實驗結(jié)果得到廣泛證實，那么對我們更好利用抗真菌藥物會有所幫助。

3.3.3 pH值霉菌性陰道炎是婦科常見病，那么陰道特殊的pH值條件是否會影響抗真菌藥物的療效呢？研究表明，在pH值≤4時，念珠菌對唑類藥物和兩性霉素B的敏感性降低，但對棘白菌素的敏感性不受影響[34]。

4 結(jié)語

IFI的發(fā)病率逐年上升，對其早期、快速、準(zhǔn)確診斷，對高?；颊叩木戎斡兄匾饬x。真菌分子生物檢測方法具有方便、快速等優(yōu)勢，有較好的應(yīng)用前景。深入研究真菌對常用抗真菌藥物的耐藥機制則有利于臨床合理使用抗真菌藥物，控制真菌耐藥性的發(fā)生。對臨床疑似IFI的患者，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用多種檢測技術(shù)進(jìn)行診斷，并合理使用抗真菌藥物，防止耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。

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（2014-07-19收稿2014-08-22修回）

（責(zé)任編委曲芬本文編輯王姝）

Laboratory study on invasive Candida infections:an update

SU Jian-rong,DING Xiu-rong
Clinical Laboratory Center,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

The epidemiology of invasive Candida infections has changed markedly in recent years.Obvious changes also have taken place in the distribution of pathogenic fungi.Most of Candida isolates are susceptible to common antifungal agents,except C. glabrata and C.krusei.With more and more widespread and profound application ofmolecular biological techniques in researches of fungi,the level of early and specific diagnosis of fungal infections has improved significantly and the understanding of resistance mechanism of fungi is alsomuch deeper.This article focuses on laboratory study on invasive Candida infections.

candidiasis;epidemiology;laboratory;diagnosis;drug resistance;fungal

R519.3

A

1007-8134(2014)05-0311-04

100050，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心（蘇建榮、丁秀榮）