李 鳳，邢 英，伊力多斯·艾合他木夫

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院VIP內(nèi)三科，烏魯木齊 830000)

1型糖尿病是T淋巴細胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，主要是由于免疫系統(tǒng)異常破壞體內(nèi)胰島細胞，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，引起體內(nèi)胰島素絕對缺乏從而導(dǎo)致血糖持續(xù)升高，出現(xiàn)糖尿病[1]。當(dāng)Th1/Th2細胞向左移動時，則抑制細胞免疫反應(yīng)，使胰島β細胞破壞，當(dāng)Th1/Th2細胞向右移動時，則具有免疫保護的作用，使胰島β細胞受到保護。包蟲病為我區(qū)常見病，雖然棘球蚴抗原B誘導(dǎo)免疫耐受中已有報道，但較少有研究顯示其在1型糖尿病早期有預(yù)防干預(yù)作用。結(jié)合棘球蚴可逃避宿主免疫殺傷及免疫監(jiān)視的作用[2]，如在1型糖尿病的早期進行免疫干預(yù)，對1型糖尿病的治療有很大的幫助[3]。本研究建立在腹腔內(nèi)注入棘球蚴抗原B介導(dǎo)的BALB/c小鼠1型糖尿病小鼠模型，并觀察不同組別小鼠糖尿病情況，分析棘球蚴抗原B對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)BALB/c小鼠1型糖尿病早期有無預(yù)防、治療作用。

1 材料與方法

1.1材料 鏈脲佐菌素購自美國sigma公司；血糖儀/血糖試紙購自德國羅氏公司；TRIzol試劑購自“Invitrogen Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；其他試劑購自TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自美國Bio-Rad公司；引物由上海生物工程公司設(shè)計合成；小鼠白細胞介素(interleukin,IL)-2、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒：武漢博士德；酶標(biāo)儀:芬蘭Thermo公司；分析軟件：Ascent software for Multiskan.

1.2方法

1.2.1建立1型糖尿病小鼠模型 6～8周齡雄性清潔小鼠，購于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物房內(nèi)(SPF級)，購置的小鼠于動物房內(nèi)常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境，1周后20只小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(鏈脲佐菌素：美國sigma公司；枸櫞酸、枸櫞酸鈉：武漢市瑞特化學(xué)用品有限公司；鏈脲佐菌素溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液pH 4.5配制)，劑量為40 mg/(kg·d),連續(xù)5 d，注射前禁食8 h，不禁水。造模后觀察飲水進食情況，監(jiān)測質(zhì)量及血糖變化。血糖≥16.7 mmol/L且次日復(fù)測仍為此水平，提示小鼠1型糖尿病模型造模成功[4]。

1.2.2NOD小鼠分組與處理 20只造模成功的NOD小鼠，采用隨機數(shù)字表法分兩組：抗原B處理組(10只),給予濃度為0.54 mg/L的細粒棘球蚴抗原B(由包蟲病研究所鞏月紅老師惠贈,經(jīng)過純化后進行注射)，100 μg/10 g經(jīng)腹腔注射，連續(xù)5 d；生理鹽水處理組(10只)，給予同等劑量(100 μg/10 g)的生理鹽水經(jīng)腹腔注射，連續(xù)5 d，并記錄兩組小鼠初始/成模后/用藥后1、2、3周的體質(zhì)量和血糖變化值。觀察至造模成功3周后摘眼球取血法，留取成模小鼠血液標(biāo)本1 mL，并以離心半徑15 cm、3000 r/min離心10 min，分離血清,頸椎脫臼處死小鼠；無菌條件下取胰腺組織于無RNA酶的凍存管內(nèi),立即放于液氮中,隨后保存于-70 ℃冰箱備用。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IL-2/IL-10在小鼠血清中的水平；實時熒光定量PCR法檢測所有小鼠胰腺的兩種細胞因子的mRNA表達。

1.3檢測方法 小鼠血清IL-2、IL-10測定：按照酶聯(lián)免疫吸附試驗操作說明書進行操作?？俁NA提?。翰捎肨RIzol法提取兩組小鼠胰腺總RNA，按說明書操作，作純度鑒定。引物序列設(shè)計IL-2、IL-10、β肌動蛋白的引物序列見表1[5]。

表1 目的基因的引物序列

1.4反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行熒光定量PCR反應(yīng),總反應(yīng)體系:20 μL:2XTaq PCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA2 μL,無RNA酶水7 μL,β肌動蛋白mRNA擴增作為內(nèi)對照,PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃ 30 s，IL-2/IL-10 55/58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃延伸5 min，共35個循環(huán),所有待測樣品均做2個平行副孔,并設(shè)立陰性對照,反應(yīng)結(jié)束后進行相關(guān)曲線及數(shù)值分析后每份組織標(biāo)本所含的2種細胞因子的拷貝數(shù)可通過SQ值與β肌動蛋白的SQ值比較得到。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體質(zhì)量變化 各組小鼠初始的體質(zhì)量、成模后體質(zhì)量、用藥后1、2周的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在用藥后3周兩組小鼠體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，生理鹽水處理組體質(zhì)量較抗原B處理組下降顯著(表2、圖1)。

2.2各組小鼠血糖變化 兩組小鼠成模后血糖水平、用藥1、2、3周時血糖水平均呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且抗原B處理組血糖升高水平低于生理鹽水處理組(P<0.05)(表3、圖2)。

2.3各組小鼠血清IL-2測定結(jié)果 IL-2OD值=0.44388892926+0.002669698，r=0.9984?？乖瑽處理組IL-2水平低于生理鹽水處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05)(表4)。

2.4各組小鼠血清IL-10測定結(jié)果 IL-10OD值=0.725213594+0.002728013,r=0.9978。抗原B處理組IL-10水平高于生理鹽水處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表5)。

表2 各組小鼠體質(zhì)量的變化 (g)

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化折線

表3 各組小鼠血糖變化 mmol/L)

圖2 各組小鼠血糖變化折線

表4 小鼠血清IL-2 OD值與實際值

表5 小鼠血清IL-10 OD值與實際值

2.5各組小鼠PCR定量結(jié)果 每次定量 PCR 反應(yīng)完畢后的融解曲線均為單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，無雜帶，與SYBR Green熒光染料結(jié)合的RNA為目的片段，進一步驗證了引物的特異性(圖3、圖4，見封三)，抗原B處理組IL-2表達量較生理鹽水處理組顯著下調(diào),IL-10顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表6)。

圖3 IL-2溶解曲線 圖4 IL-10 溶解曲線

表6 待測標(biāo)本mRNA定量的結(jié)果(拷貝數(shù)/微克胰腺組織)

3 討 論

1型糖尿病是由于遺傳易患基因的基礎(chǔ)和某些環(huán)境因素的作用下[6]，誘發(fā)針對β細胞的免疫炎癥，β細胞受破壞而致功能嚴重損壞或喪失引起的一類自身免疫性疾病。1型糖尿病患者胰島β細胞破壞高達90%以上，胰島素絕對缺乏，因而1型糖尿病病理生理過程及糖蛋白質(zhì)、脂肪分解紊亂與胰島素的缺乏有關(guān)，從而導(dǎo)致血糖的持續(xù)上升，出現(xiàn)糖尿病，以識別抗原，激活淋巴細胞，啟動損毀胰島β細胞的過程[7]?，F(xiàn)已證實，由于致病性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞之比失衡，調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)目減少且功能降低,加快了1型糖尿病的發(fā)生[7]。隨著疾病的進展，當(dāng)胰島β細胞數(shù)目破壞至85%～90%時，即可表現(xiàn)為臨床期1型糖尿病。由于1型糖尿病在臨床發(fā)病之前有一個較長的糖尿病前期階段，通常維持3～6個月，最長可達2年，在此階段應(yīng)用免疫干預(yù)治療，以及糾正致病性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞比例的破壞，阻斷破壞胰島β細胞的過程，使之恢復(fù)合成和分泌胰島素的功能，可達到預(yù)防或減輕1型糖尿病的作用,因此糾正Th1/Th2細胞亞群的失衡可能預(yù)防或治療1型糖尿病。在1型糖尿病的自身免疫過程中，Th1型細胞及細胞因子介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng),激活細胞毒性T細胞,誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開放,從而產(chǎn)生更多的氧自由基,直接破壞胰島β細胞,影響胰島素的分泌和胰島β細胞的凋亡[2-4],最終導(dǎo)致1型糖尿病的發(fā)生。因此預(yù)防胰島β細胞破壞及1型糖尿病的發(fā)生應(yīng)著眼于激活Th2型細胞因子，抑制Th1型細胞因子的活化劑釋放。IL-4和IL-10作為Th2細胞分泌的細胞因子可以抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，下調(diào)自身免疫性細胞因子。有研究表明[8-10]，將含有IL-10基因的重組腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染給胰島β細胞，使其自身分泌更多的IL-10從而延緩胰島炎和糖尿病的發(fā)生，而IL-2可誘導(dǎo)外周CD8+T細胞遷移進入炎性胰島，其機制可能通過誘導(dǎo)特異性的表達細胞毒性CD8+T細胞以產(chǎn)生顆粒酶、穿孔素等物質(zhì)介導(dǎo)胰腺β細胞凋亡,最終誘發(fā)1型糖尿病。

本實驗中,給予細粒棘球蚴抗原B注射的小鼠，在發(fā)病后血糖升高較生理鹽水組緩慢，且血糖升高不明顯，而相應(yīng)的體重的變化未向血糖一樣逐步升高，而是比較平穩(wěn)。酶聯(lián)免疫吸附實驗表明:與對照組相比,抗原B處理組小鼠血清IL-2水平降低，而IL-10水平升高，說明抗原B有降低IL-2水平、提升IL-10水平、防止胰島β細胞的進一步破壞的作用；熒光定量PCR實驗進一步證明了抗原B的作用,表明棘球蚴抗原B可以誘發(fā)免疫耐受，抑制Th1細胞生成，使發(fā)生免疫向右偏移,從而保護胰島。

棘球蚴囊液含多種抗原，抗原B(AgB)是其主要成分[11]，大量研究證實，宿主體內(nèi)IgG1、IgG4和IgE水平及嗜酸性粒細胞的增高均提示細粒棘球蚴感染過程中的免疫應(yīng)答是以Th2細胞占優(yōu)勢的。有研究表明[12]，通過AgB對健康人外周血單核細胞源的樹突狀細胞進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)細粒棘球蚴能夠長期逃避宿主的免疫監(jiān)視而在宿主體內(nèi)長期存活。包蟲病為新疆地區(qū)的多發(fā)病和特色病，新疆糖尿病的患病率極高，因此研究棘球蚴抗原B對1型糖尿病病免疫機制的影響，可以為利用細粒棘球蚴B抗原對1型糖尿病進行免疫調(diào)節(jié)治療提供新的理論基礎(chǔ)。本實驗僅是初步認為細粒棘球蚴抗原B可以降低IL-2水平，升高IL-10水平，可使Th1/Th2細胞發(fā)生免疫偏移，向著有利于胰島保護的方向，但由于數(shù)量偏少，不排除實驗結(jié)果的局限性，需進一步大量的動物實驗證實。

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