趙貝塔，趙 巍，劉鄰渭，謝 樂(lè)

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮化合物，主要分布于植物葉片、花或種子的葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞的液泡中，使植物器官發(fā)生從紅色到黑色的變化[1-4]，因而將其作為綠色健康的食品色素添加劑具有廣泛的應(yīng)用前景。酸石榴為石榴科植物石榴(PunicagranatumLinn)帶味酸的果實(shí)，我國(guó)南北各地都有種植。石榴果汁中含有3種花青素苷元和9種花青素苷，花青素苷的平均含量為60.0 mg/L(以矢車菊素-3-葡糖苷(Cy3G)為標(biāo)準(zhǔn)物)[5]；《本草綱目》中記載：“榴者，天漿也，止瀉痢、下血、脫肛、崩中帶下”[6]，其中的部分功效即與其所含花青素類物質(zhì)有關(guān)。

大孔吸附樹(shù)脂法根據(jù)吸附性和分子篩原理，可以實(shí)現(xiàn)具有一定極性的有機(jī)大分子物質(zhì)的分離，該方法具有吸附選擇性好、處理容量大、解吸條件溫和、使用周期長(zhǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)[7-9]。中藥材的大孔樹(shù)脂純化工藝在我國(guó)已有初步研究[10-11]，但對(duì)酸石榴汁花青素的純化鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)開(kāi)展酸石榴汁花青素純化樹(shù)脂的篩選及吸附-解吸性質(zhì)的研究，探討AB-8樹(shù)脂分離純化酸石榴汁花青素的工藝條件，以期為石榴汁花青素工業(yè)化生產(chǎn)工藝的建立及優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 新鮮酸石榴，2012-10采自陜西臨潼韻鮮果品專業(yè)合作社石榴園。

1.1.2 儀器與設(shè)備 PHS-3C pH計(jì)，上海精科；JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；7230G分光光度計(jì)，上海精科； LD4-2低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TSQ-280振蕩器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.1.3 供試樹(shù)脂 大孔樹(shù)脂AB-8、X-5由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；D101、D101A、NKA-9，天津海光化工有限公司生產(chǎn)。其具體性能參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 供試5種大孔吸附樹(shù)脂的理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸石榴汁的制備 將酸石榴表面洗凈擦干，手工去皮、剝出籽粒，用手工榨汁機(jī)取汁，混勻后，用孔徑0.105 mm濾布過(guò)濾，4 000 r/min 離心10 min，收集上層石榴汁清液，于 -20 ℃凍藏備用。

1.2.2 酸石榴汁紫外-可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12-13]的方法，將酸石榴汁進(jìn)行適當(dāng)稀釋，搖勻，用UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定酸石榴汁的紫外-可見(jiàn)吸收光譜曲線。

1.2.3 樹(shù)脂類型的篩選 (1)5種樹(shù)脂靜態(tài)吸附率的比較。 稱取3.0 g活化好的供試5種大孔樹(shù)脂(抽干水分)，分別置于錐形瓶中，各加入10 mL酸石榴汁，保鮮膜封口，于恒溫?fù)u床(25 ℃、100 r/min)振蕩吸附，分別在0，0.25，0.5，1，2，3，4，5 h取出過(guò)濾，在最大吸收波長(zhǎng)516 nm處測(cè)定濾液吸光度A1[10]。計(jì)算吸附率：

吸附率=[(A0×V0-A1×V1)/A0×V0]×100%。

(1)

式中：A0為吸附前樣液的吸光度；V0為吸附前樣液的體積；A1為吸附過(guò)濾后樣液的吸光度；V1為吸附過(guò)濾后樣液的體積。

(2)5種樹(shù)脂靜態(tài)解吸率的比較。 準(zhǔn)確稱取3.0 g吸附有花青素的5種大孔樹(shù)脂，分別放入錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇10 mL，于恒溫?fù)u床(25 ℃、100 r/min)中振蕩解吸，分別在0，0.25，0.5，1，2，3，4，5 h取出過(guò)濾，在516 nm處測(cè)定濾液吸光度A2，按下式計(jì)算解吸率[10]：

解吸率=[(A2×V2)/(A0×V0-A1×V1)]×100%。

(2)

式中：A0為吸附前樣液的吸光度；V0為吸附前樣液的體積；A1為吸附過(guò)濾后樣液的吸光度；V1為吸附過(guò)濾后樣液的體積；A2為解吸液的吸光度；V2為解吸后濾液的體積。

1.2.4 靜態(tài)吸附的影響因素分析 (1)花青素質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響。 首先用pH示差法測(cè)定酸石榴汁中的花青素含量[14-15]，分別吸取花青素質(zhì)量濃度為0.164 mg/mL的酸石榴汁2，4，6，8，10 mL，用10 mL容量瓶定容，將酸石榴原汁配制成花青素質(zhì)量濃度分別為0.032 8，0.065 6，0.098 4，0.131 2，0.164 0 mg/mL梯度的溶液，在516 nm處測(cè)定各質(zhì)量濃度梯度酸石榴汁的吸光度A0，于恒溫?fù)u床(25 ℃、100 r/min)中分別將各質(zhì)量濃度梯度酸石榴汁與3.0 g AB-8樹(shù)脂振蕩5 h后取出過(guò)濾，然后在516 nm處測(cè)定吸附后各濾液吸光度A1，按(1)式計(jì)算吸附率。

(2)溫度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響。 準(zhǔn)確稱取3.0 g活化好的AB-8樹(shù)脂(抽干水分)置于錐形瓶中，加入10 mL質(zhì)量濃度為0.131 2 mg/mL的酸石榴汁，分別在溫度20，25，30，35，40 ℃條件下恒溫?fù)u床(100 r/min)振蕩5 h后取出，過(guò)濾，在516 nm處測(cè)定濾液吸光度A1，按(1)式計(jì)算吸附率。

(3)酸石榴汁pH對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響。 將7份18 mL質(zhì)量濃度為0.131 2 mg/mL的酸石榴汁分別置于7只小錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0,定容至20 mL，分別在516 nm處測(cè)定其吸光度A0；然后分別移取10 mL各樣液并準(zhǔn)確稱取7份3.0 g活化好的AB-8樹(shù)脂(抽干水分)置于7只錐形瓶中，用保鮮膜封口，于25 ℃下100 r/min振蕩5 h取出過(guò)濾，在516 nm處測(cè)定各濾液的吸光度A1，按(1)式計(jì)算吸附率。

(4)解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響。 按上述靜態(tài)吸附試驗(yàn)確定的最佳條件，即采用質(zhì)量濃度為0.131 2 mg/mL的酸石榴汁(pH 2.5)在25 ℃下制備吸附試驗(yàn)樣品，過(guò)濾后得到吸附有花青素的AB-8樹(shù)脂，按每份3.0 g取7份分別放入錐形瓶中，依次加入體積分?jǐn)?shù)30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇10 mL，于恒溫?fù)u床(25 ℃、100 r/min)中振蕩5 h取出過(guò)濾，在516 nm處測(cè)定濾液吸光度A2，按(2)式計(jì)算解吸率。

(5)解吸液pH對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響。 制備吸附試驗(yàn)樣品后，過(guò)濾得到吸附有花青素的AB-8樹(shù)脂，取6份(每份3.0 g)置于小錐形瓶中。將體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇pH調(diào)至1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，取上述乙醇溶劑各10 mL分別加入錐形瓶中，于恒溫?fù)u床(25 ℃、100 r/min)中振蕩5 h后取出過(guò)濾，在516 nm處測(cè)定濾液的吸光度A2，按(2)式計(jì)算解吸率。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附的影響因素分析 (1)吸附流速對(duì)吸附率的影響。 準(zhǔn)確稱取3.0 g活化好的AB-8樹(shù)脂(抽干水分)，裝入層析柱中(Φ 2.5 cm×30 cm)，分別控制不同的流速(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min)將10 mL質(zhì)量濃度為0.131 2 mg/mL(pH 2.5)的酸石榴汁在25 ℃下過(guò)柱，待樣品液全部過(guò)柱后，在516 nm處測(cè)定其吸光度，按(1)式計(jì)算吸附率。

(2)解吸液流速對(duì)解吸率的影響。 將吸附有花青素的AB-8樹(shù)脂裝入層析柱中(Φ 2.5 cm×30 cm)，分別控制不同的流速(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min)采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇(pH 2.0)解吸，收集全部流出液，在516 nm處測(cè)定其吸光度，按(2)式計(jì)算解吸率。

1.2.6 數(shù)據(jù)的處理 采用EXCEL 2003對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸石榴汁花青素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

圖1顯示，酸石榴汁最大吸收峰出現(xiàn)在516 nm。據(jù)報(bào)道，花青素的最大吸收峰在500～520 nm[12-13]，因此酸石榴汁吸收峰符合花青素的吸收光譜特性。

圖1 酸石榴汁的紫外-可見(jiàn)吸收光譜曲線

2.2 酸石榴汁花青素最佳吸附樹(shù)脂的確定

5種樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線分別如圖2、3所示。由圖2可知，5種大孔樹(shù)脂相比，NKA-9的吸附性能最差，AB-8、X-5對(duì)酸石榴汁花青素的吸附性能均較好，但達(dá)平衡吸附時(shí)，AB-8 的吸附性能優(yōu)于X-5。

由圖3可知，AB-8的解吸性能也優(yōu)于其他4種樹(shù)脂。因此確定AB-8 為本試驗(yàn)的最佳樹(shù)脂。

圖2 5種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)的比較

2.3 靜態(tài)吸附的影響因素分析

2.3.1 花青素質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響 由圖4可知，當(dāng)酸石榴汁中的花青素質(zhì)量濃度為0.131 2 mg/mL時(shí)，樹(shù)脂的吸附率最大，在小于此花青素質(zhì)量濃度時(shí)，吸附率隨花青素質(zhì)量濃度增加而增大，隨質(zhì)量濃度繼續(xù)加大，吸附率卻有所下降，可能是由于花青素質(zhì)量濃度越高，與花青素競(jìng)爭(zhēng)吸附的多糖等成分也隨之增加,從而影響了花青素類物質(zhì)在樹(shù)脂內(nèi)部的擴(kuò)散。因此，選擇 0.131 2 mg/mL的酸石榴汁作為吸附液。

2.3.2 溫度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響 由圖5可知，在30 ℃時(shí)AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的吸附率最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，吸附率逐漸下降。溫度升高可以促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)進(jìn)而影響吸附率，但隨著分子運(yùn)動(dòng)的加劇，吸附率又會(huì)有所下降。由于室溫25 ℃下的吸附率與30 ℃時(shí)相差不大，綜合考慮，選擇室溫25 ℃為最適的吸附溫度。

圖4 花青素質(zhì)量濃度對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附率的影響

2.3.3 酸石榴汁pH對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響 由圖6可知，當(dāng)pH值從1.0上升到2.5時(shí)，AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的吸附率亦呈上升趨勢(shì)，之后又隨著pH值的繼續(xù)升高而下降。這是因?yàn)榛ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)中吡喃雜環(huán)上的氧原子使其表現(xiàn)出某些堿性性質(zhì)，而其既含有酚羥基同時(shí)又具有某些酸的性質(zhì)，因此不同pH可使花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其與大孔樹(shù)脂的相互吸引能力。本試驗(yàn)確定酸石榴汁花青素吸附的最佳pH為2.5。

2.3.4 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響 由圖7可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的解吸率也逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后，解吸率開(kāi)始下降。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低時(shí)解吸率均相對(duì)較低，這是由于低體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性較大，難以滲入樹(shù)脂的空隙結(jié)構(gòu)之中，表現(xiàn)出較差的解吸率；過(guò)高體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)花青素的溶解性差，解吸效果也不佳。所以選擇體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為解吸液。

2.3.5 解吸液pH對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響 由圖8可以看出，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作解吸液，當(dāng)pH為1.0～2.0時(shí)，AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的解吸率隨著洗脫劑pH值的升高而升高，于pH=2.0時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)pH>2.0時(shí)，解吸率開(kāi)始下降。因此，解吸液選用體積分?jǐn)?shù)70%酸化乙醇，pH=2.0最為理想。

圖6 酸石榴汁pH對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附率的影響

圖8 解吸液pH對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸率的影響

2.4 動(dòng)態(tài)吸附的影響因素分析

2.4.1 吸附流速對(duì)吸附率的影響 由圖9可知，吸附流速在0.5～1.5 mL/min時(shí),較慢的吸附流速有利于AB-8樹(shù)脂對(duì)花青素的吸附；而吸附流速大于1.5 mL/min時(shí)，由于樹(shù)脂尚未及時(shí)吸附，花青素已隨吸附液流出,因此吸附率反而下降。由此可見(jiàn),以1.5 mL/min流速通過(guò)樹(shù)脂柱, 吸附效果最好。

2.4.2 解吸液流速對(duì)解吸率的影響 從圖10可以看出，隨著解吸液流速的增加，AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的解吸率逐漸升高，當(dāng)流速為2.0 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最高；繼續(xù)增加流速，解吸率開(kāi)始下降。說(shuō)明流速過(guò)快不利于花青素類物質(zhì)的解吸，原因是流速過(guò)快時(shí)解吸液不能與被吸附的花青素充分作用而將其從樹(shù)脂上解吸出來(lái)。因此解吸流速2.0 mL/min是最適于純化和富集的流速。

圖9 吸附流速對(duì)AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附率的影響

3 討論與結(jié)論

1)樹(shù)脂類型對(duì)花青素吸附-解吸的影響較大，在AB-8、X-5、D101、D101A、NKA-9等5種大孔樹(shù)脂中，弱極性的AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素表現(xiàn)出最優(yōu)的吸附-解吸性能，這可能是由于AB-8樹(shù)脂結(jié)構(gòu)符合酸石榴汁中花青素的結(jié)構(gòu)特性。

2)pH值對(duì)酸石榴汁的吸附-解吸特性影響較大，這是由于不同pH值會(huì)使花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其與大孔樹(shù)脂相互吸附-解吸的能力，pH為2.0～2.5 時(shí)，AB-8樹(shù)脂對(duì)酸石榴汁花青素的靜態(tài)吸附-解吸效果最佳，故石榴汁花青素的加工或使用應(yīng)在酸性介質(zhì)中進(jìn)行。

3)花青素質(zhì)量濃度、溫度、流速等因素對(duì)酸石榴汁花青素的吸附-解吸都有一定程度的影響，但影響相對(duì)較樹(shù)脂類型和pH小。在具體工業(yè)化操作過(guò)程中，需要綜合考慮各種因素，力求使酸石榴汁花青素的提純效率最高。

4)AB-8 樹(shù)脂純化酸石榴汁花青素的靜態(tài)吸附-解吸的最優(yōu)工藝條件為：室溫25 ℃、pH 2.5、花青素質(zhì)量濃度0.131 2 mg/mL，解吸液采用體積分?jǐn)?shù)70%酸化乙醇(pH 2.0)；動(dòng)態(tài)吸附-解吸的最適工藝條件為：吸附流速1.5 mL/min，解吸流速2.0 mL/min。

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