繆伏榮,董志巖,劉 景

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

瓊膠(瓊脂)是存在于紅藻細胞壁中的一類多糖，是自然界中存在的重要碳源之一，是我國產(chǎn)量最大的海洋三大多糖(褐藻膠、瓊膠、卡拉膠)之一，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域[1]。瓊膠由中性的瓊膠糖(agarose)和離子性的硫瓊膠(agaropectin)組成，其中瓊膠糖是由1,3連接的β-D-半乳吡喃糖和1,4連接的3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳吡喃糖殘基反復(fù)交替連接的鏈狀中性多糖[2]。瓊膠黏度高、溶解度低，影響了其在各領(lǐng)域中的應(yīng)用；但瓊膠降解后可產(chǎn)生一定分子質(zhì)量和聚合度的瓊膠寡糖，這些寡糖具有良好的抗癌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、增強免疫[6]等藥理作用和生物活性。但由于未能找到有效降解瓊膠的途徑[7]，因此長期以來瓊膠未能得到很好的開發(fā)利用。利用瓊膠酶降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖，被認為是當(dāng)今最理想的綠色環(huán)保生產(chǎn)技術(shù)。但由于瓊膠酶來源少、活性低、價格昂貴，難以滿足瓊膠寡糖生產(chǎn)的需要，因此，篩選高產(chǎn)瓊膠酶的菌株及研究其發(fā)酵產(chǎn)酶具有重要的實際意義。

目前,已見報道的產(chǎn)瓊膠酶菌屬有Pseudomonas[8]、Pseudoalteromonas[9]、Streptomyces[10]、Alteromonas[11]、Vibrio[12]和Cytophaga[13]等。本試驗從腐爛的紫菜中分離到1株高產(chǎn)瓊膠酶的菌株，并將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.Z705[14]， 目前國內(nèi)外尚未見該菌屬產(chǎn)瓊膠酶的相關(guān)報道。本研究通過單因素試驗和正交試驗,對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件和培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,旨在為瓊膠酶的深入研究以及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來源 寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.Z705，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 純化培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，酵母浸膏1.5 g，瓊脂15 g，陳海水1 000 mL，pH 7.2；121 ℃滅菌30 min。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，酵母浸膏1.5 g，瓊脂3 g，陳海水1 000 mL，pH 7.2。

主要試劑有DNS試劑[15]、0.2 mol/L磷酸緩沖液[16]、瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏等。

1.1.3 主要儀器 主要儀器有DY-89Ⅱ電動玻璃勻漿機、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD單人超凈工作臺、熱電multican fc 酶標(biāo)儀、TDL-5000B高速冷凍離心機、DY-ⅢS水質(zhì)分析儀、FW-80高速萬能粉碎機、LDZS-30KBS立式高壓滅菌器、CRY-200恒溫搖床等。

1.2 菌株的培養(yǎng)

1.2.1 純化培養(yǎng) 將Stenotrophomonassp.Z705劃菌斜面置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，然后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 種子培養(yǎng) 在250 mL三角瓶中裝入25 mL種子培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，取培養(yǎng)好的斜面挑取1環(huán)于種子培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 在250 mL三角瓶中裝入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，按體積分數(shù)0.1%的接種量接入種子液，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)23 h。

1.3 瓊膠酶活力的測定

發(fā)酵培養(yǎng)11 h開始每2 h對發(fā)酵液取樣1次。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心5 min，其上清液即為粗酶液。根據(jù)Imoto等[17]的方法，通過DNS-還原糖法測定發(fā)酵液的酶活，用D-半乳糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。取粗酶液1 mL加入磷酸緩沖液1 mL，再加入0.3 g/L的瓊膠底物溶液1 mL，50 ℃水浴酶解30 min后再于沸水浴中滅活5 min，立即用冰水冷卻至室溫，然后加入1.5 mL的DNS試劑；在沸水浴中保溫顯色5 min后，于室溫下定容至10 mL，20 ℃、2 000 r/min離心5 min得上清液，用酶標(biāo)儀測其在520 nm波長處的吸光度；同時以滅活酶作對照。在上述反應(yīng)條件下，以1 mL酶液1 min產(chǎn)生1 μg還原糖作為1個酶活(U)。

1.4 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，按表1中的設(shè)計方案對發(fā)酵條件進行單因素試驗，分析不同因素對菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力的影響，其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基相同，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.5 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗 首先，在獲得菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵最佳條件的基礎(chǔ)上，分析不同氮源(牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4)和碳源(葡萄糖、D-半乳糖、瓊膠、果糖、麥芽糖)對菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力的影響；在篩選到最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(瓊膠)的基礎(chǔ)上進行單因素試驗，培養(yǎng)基中氮源和碳源添加水平見表1。

表1 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素試驗

1.5.2 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(瓊膠)等培養(yǎng)基組分，采用三因素三水平L9(33)的正交試驗(表2)篩選最佳培養(yǎng)基組成。所有試驗重復(fù)3次，分別平行取樣。用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。

表2 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗方案

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在微生物發(fā)酵過程中，溶氧量對好氧細菌的生長和產(chǎn)酶具有十分重要的作用。減少裝液量和增加搖床轉(zhuǎn)速均可以達到增加溶氧量的目的，使菌株快速地利用營養(yǎng)物質(zhì)，從而有利菌株產(chǎn)酶。但溶氧量必須適度，過量供給會造成酶活力的下降。由圖1可以看出，在轉(zhuǎn)速為200 r/min時，隨著裝液量的增加，瓊膠酶活力隨之升高，至裝液量為25 mL時，瓊膠酶活力最高(37.8 U/mL)；然后隨著裝液量的增加，瓊膠酶活力逐漸降低。從圖2可知，在裝液量為25 mL時，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，瓊膠酶活力隨之升高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，瓊膠酶活力達到最高(35.6 U/mL)；之后隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，瓊膠酶活力逐漸降低?？芍罴蜒b液量和搖床轉(zhuǎn)速分別為25 mL和200 r/min。

2.1.2 發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 由圖3可見，在裝液量25 mL和搖床轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下，培養(yǎng)11 h時瓊膠酶活力為5.6 U/mL；隨著發(fā)酵時間的延長，瓊膠酶活力逐漸提高，至23 h瓊膠酶活力達到最高(45.2 U/mL)；之后隨著發(fā)酵時間增加，瓊膠酶活力逐漸下降。表明最佳發(fā)酵時間為23 h。

2.1.3 初始pH值對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 海水的pH為7.2～8.3，海洋細菌最適宜生長的pH值與此關(guān)系密切。培養(yǎng)物的pH不僅直接影響菌體對營養(yǎng)物的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌，而且影響營養(yǎng)物的分解。從圖4可以看出，在培養(yǎng)基的初始pH值為6.4時，瓊膠酶活力為0.6 U/mL，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高，當(dāng)初始pH值為7.2時達到最高(46.3 U/mL)；之后隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，瓊膠酶活力逐漸下降。表明最佳初始pH值為7.2。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度是影響微生物生長和代謝的最重要的環(huán)境因素之一。適當(dāng)?shù)靥岣吲囵B(yǎng)溫度有助于促進微生物的生長和酶促反應(yīng)。從圖5可以看出，在培養(yǎng)溫度為20 ℃時，瓊膠酶活力為17.53 U/mL，隨著培養(yǎng)溫度的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，瓊膠酶活力最高(43.8 U/mL)；之后隨著培養(yǎng)溫度升高，瓊膠酶活力下降。可知最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃。

2.1.5 鹽度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 鹽度與海洋細菌的生長密切相關(guān)，是區(qū)分海洋菌與淡水菌的重要指標(biāo)。本試驗改變培養(yǎng)基的鹽度，來研究該菌株產(chǎn)酶最適的鹽度。從圖6可以看出，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基鹽度的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高，至發(fā)酵鹽度為3.4%時達最高(43.2 U/mL)；之后隨著發(fā)酵液鹽度的升高，瓊膠酶活力逐漸下降。表明此菌株是典型的海洋細菌，具有耐高滲透壓的特性，發(fā)酵培養(yǎng)的最佳鹽度為3.4%。

圖1 裝液量對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

圖3 發(fā)酵時間對Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

2.2 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素試驗

2.2.1 氮源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 圖7顯示，以牛肉膏作為氮源時，Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力最大，其次為酵母浸膏。因此，分別選用牛肉膏和酵母浸膏作為氮源，研究其對Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的影響。從圖8可以看出，隨著牛肉膏添加量的增加，瓊膠酶活力逐漸提高，至牛肉膏添加量為5.0 g/L時，瓊膠酶活力最高(45.6 U/mL)；之后隨著牛肉膏添加量升高，瓊膠酶活力下降。由圖9可見，隨著酵母浸膏添加量增加，瓊膠酶活力逐漸提高，當(dāng)酵母浸膏添加量為1.50 g/L時，瓊膠酶活力最高(41.8 U/mL)；之后隨著酵母浸膏添加量的增加，瓊膠酶活力下降。

圖7 不同氮源對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

圖8 牛肉膏添加量對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

2.2.2 碳源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 碳源是微生物生長和發(fā)酵過程中必需的營養(yǎng)物。它不僅可為微生物生長繁殖提供能量，還可為菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物提供所需的碳成分。本研究中，不同碳源對Stenotrophomonassp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖10和圖11。

圖10 不同碳源對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

圖10顯示，以瓊膠作為惟一碳源時，發(fā)酵液培養(yǎng)Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的活力最高。因此，選用瓊膠作為碳源，研究其對Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的影響。從圖11可以看出，隨著瓊膠添加量的升高，瓊膠酶活力逐漸提高，瓊膠添加量為0.30 g/L時瓊膠酶活力達到最高(43.5 U/mL)；之后隨著瓊膠添加量的升高，瓊膠酶活力逐漸降低。這可能是因為隨著瓊膠添加量的增加，培養(yǎng)基的流動性變差，發(fā)酵液通氣量降低，從而影響了菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶性能。

2.3 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗

從單因素試驗結(jié)果可以看出，Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的最佳發(fā)酵條件為：裝液量25 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時間23 h、初始pH 7.2、發(fā)酵溫度28 ℃、鹽度3.4%；發(fā)酵培養(yǎng)基中的牛肉膏、酵母浸膏和瓊膠對該菌株的產(chǎn)酶影響較大。從表3和表4可見，影響Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的因素順序為A(牛肉膏)>B(酵母浸膏)>C(瓊膠)；同時各因素對該菌產(chǎn)酶水平均有顯著的影響(P<0.05)，確定Stenotrophomonassp.Z705菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為A2B2C3，即牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、瓊膠0.30 g/L。結(jié)合最佳發(fā)酵條件，經(jīng)多次發(fā)酵試驗，該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力穩(wěn)定在87.1 U/mL左右。

表3 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

表4 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結(jié)果的方差分析

3 討 論

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是一個復(fù)雜的生理生化過程，菌體不同的營養(yǎng)條件會直接影響菌體的代謝，從而影響酶的產(chǎn)量。要提高酶的產(chǎn)量，就必須對發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行優(yōu)化[19]。不同的瓊膠酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件不相同，各種因素如培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時間等都對產(chǎn)酶有很大的影響。本研究以來源于腐爛紫菜且具有較高瓊膠降解能力的野生菌株Stenotrophomonassp.Z705為出發(fā)菌株，以提高菌株的產(chǎn)酶活性為目的，對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，確定Stenotrophomonassp.Z705菌株的最佳發(fā)酵條件為：裝液量25 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時間23 h、初始pH 7.2、發(fā)酵溫度28 ℃、鹽度3.4%；最佳培養(yǎng)基組成為：牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、瓊膠0.30 g/L，在此條件下該菌株產(chǎn)酶效果最好，瓊膠酶活力最高。經(jīng)多次發(fā)酵試驗，該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力穩(wěn)定在87.1 U/mL左右，與優(yōu)化前(平均酶活力為34.49 U/mL)相比提高了60.4%。

與國內(nèi)外已報道的瓊膠酶產(chǎn)生菌相比，首先從酶活力方面而言，菌株NBRC102603[20]為56.89 U/mL，菌株HF3-04[21]為80.7 U/mL，Bacillussp.MK03[22]為14.1 U/mL，Vibriosp.JT0107[23]為66 U/mL，AgarivoransalbusYKW-34[24]為83 U/mL，均低于本研究中的Stenotrophomonassp.Z705菌株；其次從瓊膠酶活力達到最高時的發(fā)酵時間而言，MA-B22[25]需要60 h，Halomonassp.DT-3[26]需要36 h，而本研究供試菌株僅需23 h。目前我國尚未有工業(yè)化產(chǎn)瓊膠酶的菌株，所需產(chǎn)品均來自國外，價格昂貴，而本研究供試菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分簡單低價、培養(yǎng)條件簡便，穩(wěn)定性好，具有一定的生產(chǎn)潛力，可為瓊膠酶的深入研究及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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