馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000)

馬鈴薯病毒家族成員包括X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)、A病毒(PVA)、S病毒(PVS)、卷葉病毒(PLRV)等，其中PVX是馬鈴薯病毒家族成員的典型類型。攜帶X病毒的馬鈴薯植株通常不表現(xiàn)出癥狀，但感染X病毒可導(dǎo)致植株葉片失綠、變小和塊莖壞死病變等。PVX與PVY和PVA復(fù)合感染可導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀，由此造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失超過任何單獨病毒侵染。X病毒主要靠汁液接觸傳播，也可以通過昆蟲咀嚼式口器機械傳播，除馬鈴薯外，煙草、辣椒、番茄也會成為X病毒的寄主[1]。

由于馬鈴薯是無性繁殖作物，隨著脫毒種薯種植代(年)數(shù)的增加，病毒在植株體內(nèi)不斷積累以及在植物間互相傳播，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸下降，而且還會使馬鈴薯感染其他種類的病毒和類病毒。因此，及時、準(zhǔn)確地檢測田間種植馬鈴薯的帶毒情況，采用莖尖剝離脫毒法、超低溫療法[2-3]等脫毒技術(shù)控制病毒的蔓延，可為脫毒馬鈴薯的推廣種植奠定基礎(chǔ)。

檢測馬鈴薯病毒最常用的方法有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)、反轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)和實時熒光定量PCR法。DAS-ELISA法操作簡單、直觀、實用性強，準(zhǔn)確度較高，但檢測病毒含量較低的馬鈴薯時，靈敏度和準(zhǔn)確度不高，會出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。而RT-PCR檢測技術(shù)即使在馬鈴薯病毒含量極低時也可以快速檢測出來，該方法具有靈敏、快速、準(zhǔn)確度高、特異性強等優(yōu)點，適用于馬鈴薯及其他植物病毒的檢測[4-6]。在RT-PCR檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，研究人員應(yīng)用多重RT-PCR對馬鈴薯多種病毒同時進行檢測，如Nie等[7]檢測了馬鈴薯PVX、PVY、PVA、PVS、PLRV 5種病毒和1種紡錘類病毒(PSTVd)；王中康等[8]、董代幸等[9]分別同時檢測了馬鈴薯PVX、PVS、PVY、PLRV以及PVX、PVA、PVY、PLRV 4種病毒。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的進一步發(fā)展，Bright等[10]利用該方法檢測了馬鈴薯PVX、PVY、PVA和PLRV 4種病毒；Sheila 等[11]采用該方法同時檢測了PVX、PVS、番茄斑萎病毒(TSWV)和PLRV 4種病毒。多重RT-PCR法和實時熒光定量PCR法極大地提高了馬鈴薯病毒的檢測效率，并逐漸應(yīng)用到其他植物、動物病毒以及微生物的檢測上，但多重RT-PCR法和熒光定量PCR法易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，Gambino等[12]、牛建新等[13]在利用多重RT-PCR檢測葡萄病毒時也有類似報道。國內(nèi)研究者采用RT-PCR方法檢測了不同地區(qū)的馬鈴薯X病毒[14-16]，但尚未見用RT-PCR法檢測和分析陜北地區(qū)馬鈴薯PVX的報道。因此，本試驗以陜北8個縣(區(qū))種植2～3代的疑似攜帶病毒馬鈴薯為研究對象，采用RT-PCR方法檢測該地區(qū)的馬鈴薯PVX，并對PVX的外殼蛋白(Coat protein，CP)基因序列進行分析，明確病毒的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的推廣種植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品的采集 于2013-07-10在馬鈴薯生長盛期至成熟期，采集疑似攜帶病毒馬鈴薯植株的葉片，于常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中，運回實驗室后于4 ℃冰箱保存。馬鈴薯樣品信息見表1。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器有PCR儀(朗基，杭州)及電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，意大利)。Trizol試劑及cDNA合成試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pGEM-Teasy載體、TaqDNA聚合酶、dNTP、10×buffer均購自北京全式金生物科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的PVX CP基因序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5設(shè)計1對特異引物，上游引物為5′-ACAGGCC-ACAGGGTCAACTAC-3′，下游引物為5′-CATCT-AGGCTGGCAAAGTCGT-3′。預(yù)期擴增片段長度為620 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌TE (pH 8.0)稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯X病毒的RT-PCR檢測 1)總RNA的提取。采用Trizol法，參照文獻(xiàn)[17]方法進行，略做改動。具體步驟是：稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 mL離心管加入1 mL Trizol液，將研磨液與Trizol液混合均勻；4 ℃、12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入0.2 mL氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液(水相)于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L氯化鈉，混合均勻，室溫放置5～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，將沉淀用1 mL 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2次，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的ddH2O，于-80 ℃條件下保存。

表 1 供試馬鈴薯樣品的信息

2) cDNA的合成。按照cDNA合成試劑盒說明書操作，對提取的馬鈴薯葉片總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系如下：馬鈴薯總RNA 5 μL，Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL) 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScriptRTEnzyme Mix 1 μL，加RNase-free Water至20 μL。混勻后，水浴鍋中42 ℃孵育30 min，在PCR儀中于85 ℃條件下加熱失活5 min。

3) PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測。PCR反應(yīng)體系：cDNA 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL PCR擴增產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer混勻，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中照相。

1.2.2 CP基因的克隆及序列測定 用DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，將其與pGEM-Teasy載體連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在加有IPTG和X-gal的LB平板上篩選白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定。將含目的條帶的陽性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.3 CP基因序列分析 用DNAstar軟件分析CP基因的序列相似性，用Clustalx 1.83和Mega 5.0軟件進行序列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在GenBank中搜索國內(nèi)外12個不同地區(qū)(表2)的馬鈴薯X病毒CP基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析陜北馬鈴薯X病毒的來源及不同地區(qū)陜北馬鈴薯X病毒CP基因變異程度。

表 2 國內(nèi)外12個不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的信息

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯X病毒CP基因的RT-PCR檢測

對采自陜北8個縣(區(qū))的馬鈴薯葉片cDNA的PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，均能擴增出長度為620 bp左右的目的條帶，表明這些馬鈴薯植株均感染了X病毒。但不同縣(區(qū))樣品PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度不一，其中，宜川縣丹川鎮(zhèn)(7泳道)樣品的PCR產(chǎn)物條帶最亮，神木縣爾林兔鎮(zhèn)(1泳道)、榆陽區(qū)馬合鎮(zhèn)(2泳道)樣品PCR產(chǎn)物條帶亮度次之，其他5個縣(區(qū))樣品PCR產(chǎn)物條帶亮度較淡?？赡苁怯捎谔崛〉臉悠房俁NA品質(zhì)不同，導(dǎo)致PCR體系中cDNA品質(zhì)有差異所致。

圖 1 馬鈴薯X病毒CP基因的RT-PCR檢測結(jié)果

2.2 馬鈴薯X病毒CP基因序列的分析

將X01～X08 8個馬鈴薯X病毒CP基因片段提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的GenBank登錄號分別為KJ620839、KJ620840、KJ620841、KJ620842、KJ620843、KJ620844、KJ620845、KJ620846。用DNAstar軟件比對后發(fā)現(xiàn)，8個CP基因序列之間均有不同程度的差異，其(G+C)含量在50.0%～51.29%，故從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索(G+C)含量在49.58%～51.96%的其他12個地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因，進行序列一致性分析，結(jié)果表明，本研究中的8個CP基因序列一致性較高，其中X02(榆陽區(qū))與X03(定邊縣)樣品CP基因一致性最低，為95.2%；X01(神木縣)與X02(榆陽區(qū))樣品CP基因一致性最高，為99.4%；來自陜北8個縣(區(qū))樣品與從GenBank中搜索的國內(nèi)外其他12個地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因的一致性為92.9%～98.5%。

系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示，陜北8個縣(區(qū))馬鈴薯X病毒CP基因的系統(tǒng)進化來源相似，雖聚為一個大類，但又分為2個區(qū)，其中，子長縣、寶塔區(qū)、定邊縣和志丹縣X病毒的CP基因序列分在Ⅰ區(qū)，與阿根廷、加拿大及我國黑龍江CP基因分在同一個區(qū)；神木縣、榆陽區(qū)、綏德縣和宜川縣X病毒的CP基因序列分在Ⅱ區(qū)，同時北京CP基因分在該區(qū)。就地理位置而言，Ⅰ區(qū)的陜北4個采樣地主要分布在東北方向，靠近內(nèi)蒙古和山西；而Ⅱ區(qū)的陜北4個采樣地分布在西南方向，與甘肅和寧夏毗鄰。我國新疆、寧夏與印度、美國的CP基因序列來源相似，同分在Ⅲ區(qū)；我國福建與澳大利亞的CP基因序列相似，我國貴州與英國的CP基因序列相似，以上4個CP基因同分在Ⅳ區(qū)。

3 討 論

本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陜北8個縣(區(qū))最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級脫毒種薯種植2～3年后，馬鈴薯葉片開始出現(xiàn)花葉、皺縮等癥狀，薯塊性狀發(fā)生變化，產(chǎn)量也呈下降趨勢，說明X病毒或其他病毒可能在馬鈴薯體內(nèi)存在。究其原因，一是地方檢疫部門對馬鈴薯脫毒苗及各級種薯的檢驗檢疫監(jiān)督不嚴(yán)，造成將帶毒種薯發(fā)放給農(nóng)民種植；二是大部分農(nóng)戶分散種植馬鈴薯，且馬鈴薯與其他作物倒茬輪作種植，在倒茬種植時，原有茄科植物如西紅柿、辣椒等感染的各種病毒，會由機械或汁液傳播感染馬鈴薯。

圖 2 陜北及國內(nèi)外不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進化樹

RT-PCR分子檢測技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地檢測馬鈴薯的攜帶病毒情況，是近年來國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍的病毒檢測技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用對脫毒馬鈴薯種薯的推廣及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。筆者認(rèn)為，采用RT-PCR法檢測病毒時，只要提取的馬鈴薯總RNA品質(zhì)高，設(shè)計不同的特異引物，就能擴增出預(yù)期的目的條帶，不會發(fā)生假陰性現(xiàn)象，檢測效果好。另外，在用RT-PCR法檢測常見的PVX、PVY、PVS、PVA、PVM和PLRV 6種病毒以及類病毒PSTVd時，可通過改變PCR反應(yīng)體系中的溫度，從而在PCR儀中實現(xiàn)多種病毒的同步檢測。

馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進化樹表明，本研究中的陜北8個縣(區(qū))馬鈴薯X病毒CP基因的序列一致性為95.2%～99.4%，與國內(nèi)外12個不同地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因序列的一致性在92.9%～98.5%。曲靜等[18]發(fā)現(xiàn)，山東馬鈴薯X病毒分離物與GenBank中15個有代表性的X病毒株系或分離物的CP基因序列的一致性在80.1%～99.7%；張威等[19]發(fā)現(xiàn)，黑龍江馬鈴薯X病毒分離物與GenBank中17個X病毒分離物的CP基因序列一致性在75.5%～99.2%；姚東校等[20]發(fā)現(xiàn)，貴州馬鈴薯X病毒分離物與19個不同地區(qū)X病毒分離物的CP基因序列一致性在78.6%～97.5%。本研究中，陜北馬鈴薯X病毒CP基因與其他12個地區(qū)CP基因序列一致性較高，可能是因為陜北地區(qū)近幾年引入馬鈴薯品種較多，引種時間較短所致。這與Kawakami等[21]、Robertson等[22]對馬鈴薯X病毒CP基因序列的系統(tǒng)進化分析結(jié)果一致。總之，陜北地區(qū)馬鈴薯X病毒CP基因存在一定程度的變異，但其系統(tǒng)進化來源相似，聚為一個大類。主要是引種速度較快、引入品種較多所致。由于采集地和土壤性質(zhì)不同，有關(guān)引進品種、機械操作方式和種植年代不同引起的馬鈴薯X病毒CP基因序列變異，還有待進一步研究。

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