馬詩(shī)鈺，周蘭英， 熊海燕，蒲光蘭，劉 煥，蔡利娟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 雅安 625014)

杉科(Taxodiaceae)隸屬于裸子植物門(Gymnospermae)松杉綱(Coniferopsida)松杉目(Pinales)，科下含10屬16種，主要分布于東亞、北美及大洋洲。中國(guó)產(chǎn)5屬7種，引入栽培4屬7種，現(xiàn)存各屬均為古老的孑遺類群[1-2]。從1890年正式創(chuàng)立杉科至今，關(guān)于該科植物種、亞種、變種分類及親緣關(guān)系一直存在分歧。1890-1926年，松杉科植物分類爭(zhēng)議最大，各學(xué)者對(duì)族、亞族、屬的分類意見均不統(tǒng)一。1926年，Pilger對(duì)裸子植物進(jìn)行系統(tǒng)整理，結(jié)束了杉科分類混亂的局面，為后繼學(xué)者的研究奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)發(fā)展中，杉科分類問(wèn)題依舊存在，焦點(diǎn)多集中在杉木、落羽杉、柳杉等族、亞族或組等問(wèn)題上。如Hida[3]認(rèn)為，杉木、柳杉、落羽杉各自成為一個(gè)亞科，并包含相應(yīng)屬。而Price等[4]認(rèn)為，應(yīng)在科下分組，且柳杉屬與落羽杉屬、水松屬為一組，不涉及杉木。此外，對(duì)不同屬間及同屬不同植物分類的分歧也廣泛存在[5-7]。

分類學(xué)并不單獨(dú)以某一種水平上的依據(jù)解決植物分類問(wèn)題[8]。近年來(lái)，隨著科技水平的不斷發(fā)展，關(guān)于杉科植物形態(tài)結(jié)構(gòu)[9]、孢粉學(xué)[10]、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)[5,7]及分子水平[11-13]等研究?jī)?nèi)容不斷完善，從不同角度為分類提供了輔助依據(jù)。在細(xì)胞染色體水平上，有關(guān)杉科植物的核型雖已有部分報(bào)道[14-18]，但仍缺乏對(duì)杉科染色體核型及親緣關(guān)系、進(jìn)化程度的探討，且已有研究多集中在20世紀(jì)80年代，這些研究均采用手工配對(duì)分析染色體，誤差較大，在一定程度上影響了核型分析的準(zhǔn)確性[19]。本研究運(yùn)用AI細(xì)胞遺傳工作系統(tǒng)對(duì)5種杉科植物核型進(jìn)行了全面分析，探討適合的取材時(shí)間、制片技術(shù)等，以期為該杉科植物染色體制片技術(shù)的優(yōu)化提供依據(jù)；且通過(guò)核型研究，為該科植物染色體圖像分析數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、杉科演化過(guò)程等提供部分細(xì)胞學(xué)證據(jù)，并進(jìn)一步為杉科遺傳資源保護(hù)、遺傳育種(倍性育種等)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的5種杉科植物分別為杉木、柳杉、日本柳杉、池杉和落羽杉，產(chǎn)地見表1。采集方法為：在林地中隨機(jī)抽取30株長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，于樹冠中上部東、西、南、北4個(gè)方位上分別采集1個(gè)球果(4個(gè)/株)，種子取出后混勻備用。

表 1 四川5種杉科植物材料的來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

選取飽滿種子于25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，待幼根長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)取樣。采用常規(guī)壓片法進(jìn)行染色體制片，上午08:00-10:00切取生長(zhǎng)旺盛的根尖作試驗(yàn)材料，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉體積比為1∶1的混合液于室溫下處理6～8 h，以卡諾氏Ⅰ液(V(無(wú)水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)為固定液于4 ℃冰箱中固定24 h，1 mol/L HCl 60 ℃水浴條件下解離6～8 min，改良苯酚品紅染液染色及壓片。用Nikon55i顯微鏡觀察，用AI Cytovision軟件對(duì)中期相細(xì)胞進(jìn)行顯微拍照和保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)中,5種材料均統(tǒng)計(jì)30個(gè)以上的合格細(xì)胞，以超過(guò)85%細(xì)胞具有的相同染色體數(shù)，作為該種植物的染色體數(shù)目[20]；每種植物均取5個(gè)以上染色體分散良好、染色體縱向收縮程度較為一致以及縊痕區(qū)清晰的中期相照片進(jìn)行核型分析，所有核型參數(shù)均以5張照片測(cè)量結(jié)果的平均值為分析數(shù)據(jù)。用Image Pro Plus軟件測(cè)量染色體的全長(zhǎng)、臂長(zhǎng)(具隨體的染色體將隨體長(zhǎng)度計(jì)算在內(nèi))；參照李懋學(xué)等[20]的方法，計(jì)算平均臂比、核型不對(duì)稱系數(shù)、最長(zhǎng)/最短染色體、著絲點(diǎn)指數(shù)均值；依據(jù)染色體分類系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)[21]確定染色體類型，并得出核型公式；參照Stebbins[22]的核型分類標(biāo)準(zhǔn)確定核型類型；染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)按Kuo等[23]的方法計(jì)算并命名。根據(jù)染色體核型參數(shù)及形態(tài)特征，用AI Cytovision軟件進(jìn)行同源染色體配對(duì)，用Excel 2003軟件將各種植物的染色體測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，分別以最長(zhǎng)/最短染色體值、平均臂比為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制5種杉科植物的核型不對(duì)稱性程度散布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種杉科植物的核型

5種植物的核型參數(shù)、核型特征分別見表2和表3。染色體形態(tài)、核型及核型模式見圖1。

表 2 四川5種杉科植物的核型參數(shù)

續(xù)表 2 Continued table 2

由表2和表3以及圖1可知，5種杉科植物的染色體數(shù)目均為2n=2x=22；杉木核型公式為2n=2x=22=20m(2SAT)+2sm，柳杉和日本柳杉的核型公式為：2n=2x=22=20m+2sm，池杉和落羽杉的核型公式為：2n=2x=22=22m，均為2倍體。染色體主要由近中部(sm)和中部著絲點(diǎn)染色體(m)組成，近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)有杉木10號(hào)、柳杉11號(hào)、日本柳杉9號(hào)染色體，其余均為中部著絲點(diǎn)染色體(m)，隨體僅出現(xiàn)在杉木4號(hào)染色體上。核型不對(duì)稱系數(shù)變化較小，為54.24%～55.57%，說(shuō)明5種植物均為較原始類型；平均臂比值差異不大，為1.20～1.31；最長(zhǎng)/最短染色體值為1.36～2.18；柳杉、日本柳杉、池杉、落羽杉的染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成中只有M1和M2，無(wú)L和S；杉木的染色體相對(duì)組成中包含M1、M2和S，無(wú)L。按核型分類標(biāo)準(zhǔn)[22]，5種植物被分為3類：杉木為2B型，柳杉和日本柳杉均為2A型，池杉和落羽杉均為1A型。

表 3 四川5種杉科植物的核型特征

2.2 5種杉科植物核型的不對(duì)稱性程度

圖2中，坐標(biāo)點(diǎn)的相對(duì)位置反映了5種杉科植物的不對(duì)稱性、進(jìn)化程度及其相互之間的關(guān)系，植物坐標(biāo)點(diǎn)越靠近左下方，表明其核型的不對(duì)稱性越低，種越原始，種的進(jìn)化程度也相對(duì)越低；相反，越靠近右上方，其核型的不對(duì)稱性越高，種的進(jìn)化程度越高[22]。由圖2和表3可知，5種杉科植物的核型不對(duì)稱性系數(shù)依次為：落羽杉(54.24%)<池杉(54.52%)<日本柳杉(54.78%)<柳杉(55.21%)<杉木(55.57%)，說(shuō)明杉木的進(jìn)化程度最高，柳杉和日本柳杉的進(jìn)化程度較低，池杉和落羽杉的進(jìn)化程度最低，進(jìn)化程度由高到低順序?yàn)樯寄?柳杉>日本柳杉>池杉>落羽杉。

圖 1 四川5種杉科植物的染色體形態(tài)(a，100×)、核型(b)及核型模式(c)

圖 2 四川5種杉科植物的核型不對(duì)稱性程度散布圖

3 討論與結(jié)論

3.1 5種杉科植物的核型

本研究中，杉科5種植物染色體數(shù)目均為22條，核型公式與已報(bào)道研究結(jié)果[14-18]基本一致，但著絲點(diǎn)位置、隨體位置及有無(wú)、B染色體、非整倍性變異等現(xiàn)象存在差異，這表明植物的核型在種間具有豐富的多樣性[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，僅杉木4號(hào)染色體上具隨體，其余4種植物所有染色體上均無(wú)隨體；池杉(2n=2x=22m)與落羽杉(2n=2x=22m)所有染色體的著絲點(diǎn)均位于染色體中部；5種杉科植物均為二倍體且沒有B染色體，這與前人的部分研究結(jié)果[8,25-26]一致，但也存在差異[13-15,18,27-28]。隨體是由染色體不等臂間發(fā)生倒位或不等相互異位造成的，一定程度上反映了物種的進(jìn)化程度[29-30]。供試5種杉科植物染色體相對(duì)較穩(wěn)定，總體進(jìn)化程度相對(duì)較原始，雖然進(jìn)化速度相對(duì)緩慢，但內(nèi)部細(xì)微變異一直存在，這與Groth 等[31]的觀點(diǎn)一致。有關(guān)染色體著絲點(diǎn)位置確定的研究結(jié)果表明：當(dāng)染色體形態(tài)各異，且其出現(xiàn)折疊或扭曲時(shí)，人工分析可能會(huì)影響分析結(jié)果[32]，本試驗(yàn)采用AI細(xì)胞遺傳工作系統(tǒng)分析染色體具有可靠性。B染色體是正常染色體之外的1條染色體，是發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的證據(jù)，在不同生境條件下，植物為適應(yīng)環(huán)境易發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和倍性變異，而B染色體多出現(xiàn)于克服了不利環(huán)境的影響且生長(zhǎng)在高海拔條件下的植物中[29]，這表明同一物種經(jīng)過(guò)不同環(huán)境馴化后會(huì)形成不同程度的進(jìn)化和變異。因此，對(duì)不同生境同一物種的核型分析可以增加遺傳多樣性幾率，為分類學(xué)提供更廣泛的依據(jù)。本試驗(yàn)不足之處在于沒有分析不同種源地該科所有植物，后續(xù)研究可以選取多個(gè)材料，以對(duì)比不同生境中植物發(fā)生不定向變異的程度。

3.2 5種杉科植物的進(jìn)化趨勢(shì)及親緣關(guān)系

植物核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)是由對(duì)稱向不對(duì)稱發(fā)展，系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物，大多具有較對(duì)稱的核型，而不對(duì)稱的核型則主要見于衍生的、特化的以及比較進(jìn)化的植物類群中[22]。染色體特征是細(xì)胞分類學(xué)的重要指標(biāo)，種屬間、種內(nèi)及品種間染色體特征常出現(xiàn)不同程度分化[33]，在此水平上檢測(cè)種間遺傳變異程度以及推斷親緣進(jìn)化關(guān)系具有一定的科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)中，平均臂比值由大到小順序?yàn)樯寄?柳杉>日本柳杉>池杉>落羽杉；最長(zhǎng)/最短染色體平均值由大到小順序?yàn)樯寄?池杉>柳杉>日本柳杉>落羽杉。核型不對(duì)稱系數(shù)值由大到小順序?yàn)樯寄?55.57%)>柳杉(55.21%)>日本柳杉(54.78%)>池杉(54.52%)>落羽杉(54.24%)，杉木核型不對(duì)稱程度最高，相對(duì)最為進(jìn)化；落羽杉的核型不對(duì)稱程度最低，相對(duì)最為原始；柳杉與日本柳杉的進(jìn)化程度相近，柳杉較日本柳杉進(jìn)化程度高，且兩者明顯比池杉進(jìn)化程度高。此結(jié)果與于永福[34]的研究結(jié)果存在差異，雖然其并未給出不同屬間植株具體進(jìn)化順序，但對(duì)杉科各屬間的進(jìn)化順序排列為杉木屬>落羽杉屬>柳杉屬。

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