孫相和，寧紅梅，李 沖，陳玲麗，孔令蕓，葛亞明

(河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鉛(Lead，Pb)是一種多親和性有毒重金屬，在日常生活中被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。雖然鉛及其化合物在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，但會(huì)對(duì)人和動(dòng)物體產(chǎn)生毒害作用。誤食含鉛物質(zhì)或者吸入鉛及其化合物，都可引起鉛中毒，其對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)均能造成嚴(yán)重?fù)p傷[1-2]。有研究表明，鉛對(duì)兒童智力和生長(zhǎng)發(fā)育危害嚴(yán)重，特別對(duì)記憶能力的損害尤為明顯[3]。鉛毒性持久，半衰期長(zhǎng)，不易排出體外，在動(dòng)物體內(nèi)容易富集，人食用鉛富集動(dòng)物的肉類(lèi)產(chǎn)品會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利影響。鉛不是動(dòng)物體生長(zhǎng)必需的元素，且可對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生累積性毒害作用[4]。因此，動(dòng)物體內(nèi)理想狀態(tài)下鉛含量應(yīng)為零[5]。

目前，鉛的廣泛應(yīng)用使人和動(dòng)物的生活環(huán)境受到其嚴(yán)重污染[6-7]，并已嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物的健康。有調(diào)查顯示，鉛在職業(yè)性慢性中毒中排行首位[8]。鉛對(duì)兒童大腦功能的損傷效應(yīng)往往是長(zhǎng)期且不可逆的[9-10]，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的損害使得兒童和幼齡動(dòng)物產(chǎn)生認(rèn)知缺陷[11]。另外，鉛對(duì)動(dòng)物免疫和生殖方面的損害也得到越來(lái)越多的關(guān)注[12-14]。然而，關(guān)于鉛中毒對(duì)動(dòng)物體整體損害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究進(jìn)行了對(duì)小鼠灌胃醋酸鉛的急性毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)醋酸鉛對(duì)小鼠的急性毒性效應(yīng)，為深入研究鉛的毒性作用機(jī)制、明確鉛毒性作用的靶器官、提高人類(lèi)對(duì)鉛毒性的認(rèn)識(shí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種健康小鼠164只，4周齡，雌雄各半，由河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠每籠飼養(yǎng)5只，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2) ℃，相對(duì)濕度42%～57%。

1.1.2 試劑與儀器 醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]，分析純，購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20120413，使用時(shí)用去離子水配制成不同濃度。電子天平，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Leica RM 2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，購(gòu)自Leica Microsystems Nussloch GmbH；Leica DMIL LED顯微鏡及其照相系統(tǒng)，購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2 方 法

試驗(yàn)前對(duì)小鼠進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察，觀察期內(nèi)小鼠自由采食、飲水和活動(dòng)。

1.2.1 醋酸鉛半數(shù)致死劑量(LD50)的測(cè)定 預(yù)試驗(yàn)：將小鼠隨機(jī)分為6組，每組4只，雌雄各半，各組醋酸鉛劑量分別為1 000，2 000，4 000，8 000，16 000和32 000 mg/kg，以小鼠平均體質(zhì)量計(jì)算，按20 mL/kg 劑量灌胃給藥，觀察臨床癥狀并記錄死亡情況，判斷0致死量的醋酸鉛劑量(LD0)和全數(shù)致死量的醋酸鉛劑量(LD100)。根據(jù)給藥劑量，按公式i=(LD100-LD0)/(n-1)確定正式分組劑量公比r的對(duì)數(shù)i，并計(jì)算出劑量公比r=lg-1i，其中n為預(yù)分組數(shù)。

正式試驗(yàn)：據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，將小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半，按給藥劑量由低到高分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，按1/r等比稀釋法配制等比濃度醋酸鉛溶液，按20 mL/kg劑量灌胃給藥，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組醋酸鉛的灌胃劑量分別為4 033.7，5 762.4，8 232.0，11 760.0，16 800.0，24 000.0 mg/kg，統(tǒng)計(jì)36 h內(nèi)小鼠的死亡情況。利用Bliss法計(jì)算LD50及其95%可信限。

1.2.2 醋酸鉛對(duì)小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響 將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，共分4組，每組20只，雌雄各半，根據(jù)攻毒劑量依次分為對(duì)照組、低鉛組、中鉛組和高鉛組，各組分別飲用醋酸鉛濃度為0，2.4，4.8和9.6 mmol/L的去離子水[15]，飲毒時(shí)間9 d。分別于自由飲水染毒后0和9 d測(cè)定試驗(yàn)小鼠體質(zhì)量，記為初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量，并記錄體質(zhì)量變化程度。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(10 d)，統(tǒng)計(jì)存活的小鼠數(shù)，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖觀察后取出各臟器，用吸水紙吸去污血，稱(chēng)取各臟器的質(zhì)量，以臟器質(zhì)量/100 g體質(zhì)量的比值表示各臟器指數(shù)。

1.2.3 醋酸鉛對(duì)小鼠臟器影響的病理組織學(xué)檢查 對(duì)觀察期內(nèi)死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)全部存活小鼠進(jìn)行解剖檢查，解剖檢查前24 h禁食不禁水，檢查組織器官是否存在明顯病理變化。同時(shí)采集小鼠的大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟組織，固定在體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液中，并將組織脫水、包埋、切片、常規(guī)HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，以考察醋酸鉛對(duì)各內(nèi)臟器官的急性毒性效應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 17.0和Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸鉛對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)

預(yù)試驗(yàn)初步確定0致死和全數(shù)致死量的醋酸鉛劑量分別為4 000和24 000 mg/kg，i=0.156，r=1.43，1/r=0.7，據(jù)此醋酸鉛溶液的灌胃劑量由高到低依次為24 000.0 mg/kg劑量組(Ⅵ組)、16 800.0 mg/kg劑量組(Ⅴ組)、11 760 .0 mg/kg劑量組(Ⅳ組)、8 232.0 mg/kg劑量組(Ⅲ組)、5 762.4 mg/kg劑量組(Ⅱ組)和4 033.7 mg/kg劑量組(Ⅰ組)。

急性毒性試驗(yàn)中，灌胃后1 h小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡，36 h內(nèi)小鼠死亡情況見(jiàn)表1。利用Bliss法計(jì)算醋酸鉛經(jīng)口灌胃LD50的回歸方程為y=-15.328+5.052 1lgx，其中y為醋酸鉛對(duì)小鼠的致死概率，x為醋酸鉛灌胃劑量的常用對(duì)數(shù)值，半數(shù)致死劑量LD50=10 562 mg/kg，LD5095%的可信限是8 609.4～3 023 mg/kg (Feiller校正)，LD5=4 990.6 mg/kg，LD95=22 353 mg/kg。

表 1 不同劑量醋酸鉛灌胃36 h內(nèi)小鼠的死亡情況(n=10)

2.2 醋酸鉛對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

醋酸鉛對(duì)小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響見(jiàn)表2和表3。由表2可知，各組間小鼠初始體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，隨著試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)醋酸鉛飲用量的增加，個(gè)別小鼠發(fā)生應(yīng)激性死亡，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組間小鼠的終末體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組和中鉛組小鼠終末體質(zhì)量與初始體質(zhì)量差異極顯著(P<0.01)，高鉛組小鼠終末體質(zhì)量與初始體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，低鉛組小鼠的終末體質(zhì)量與初始體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。各組間小鼠終末體質(zhì)量與初始體質(zhì)量的變化差異也不顯著(P>0.05)。

表 2 醋酸鉛對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(n=20)

表 3 醋酸鉛對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可知，小鼠大腦指數(shù)隨著醋酸鉛劑量的增加呈降低趨勢(shì)，小鼠心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)隨醋酸鉛劑量的增加總體呈升高趨勢(shì)，肺臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的變化無(wú)規(guī)律性。與對(duì)照組相比，低鉛組小鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，中鉛組和高鉛組小鼠腎臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；醋酸鉛處理組與對(duì)照組其他臟器指數(shù)的差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 醋酸鉛處理小鼠臟器的病理剖檢

對(duì)觀察期內(nèi)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)全部存活小鼠進(jìn)行剖檢，觀察小鼠的病理組織學(xué)變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 醋酸鉛處理小鼠的病理組織學(xué)變化 (×400)

2.3.1 一般剖檢變化 與對(duì)照組相比，染毒組小鼠精神沉郁，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)緩慢。飲用醋酸鉛1 d后，低鉛組小鼠死亡1只，剖檢觀察各組織器官無(wú)明顯變化，與對(duì)照組小鼠組織器官相似；高鉛組小鼠分別在飲用醋酸鉛第6天和第8天共死亡3只，死亡小鼠心臟腫脹，脾臟有出血現(xiàn)象且體積增大，腎臟明顯腫大且質(zhì)地變軟，大腦、肺和肝臟剖檢變化不明顯。與對(duì)照組相比，染毒組小鼠心臟、脾臟和腎臟體積均有不同程度的增大，其中高鉛組小鼠心臟、脾臟和腎臟體積增大較明顯，其他組織器官剖檢變化不明顯。

2.3.2 病理組織學(xué)變化 由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟組織無(wú)異常變化。隨著醋酸鉛劑量的增加，染毒小鼠大腦皮層顆粒細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)纖維萎縮斷裂，并有纏結(jié)現(xiàn)象(圖1-A4)；心肌纖維間隙擴(kuò)張，肌纖維出現(xiàn)斷裂(圖1-B4)；高鉛組小鼠肺泡變化明顯，肺泡壁有聚集粘連現(xiàn)象(圖1-C4)，其他組與對(duì)照組無(wú)明顯差別；肝臟小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列混亂且有斷裂現(xiàn)象，竇狀隙擴(kuò)張，肝細(xì)胞大小不均勻，細(xì)胞有空泡化現(xiàn)象(圖1-D4)；隨著醋酸鉛劑量的增加，小鼠脾臟出血現(xiàn)象逐漸明顯，紅髓白髓界限不明顯，巨噬細(xì)胞數(shù)量減少(圖1-E4)；腎臟近曲小管管腔收縮，致密斑數(shù)量增加，刷狀緣不明顯(圖1-F4)。

3 討 論

半數(shù)致死劑量(LD50)是指在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)特定感染途徑，使某種試驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡所需化學(xué)物質(zhì)的最小劑量，是描述化學(xué)物質(zhì)毒性強(qiáng)弱的常用指標(biāo)。目前可以采用很多方法計(jì)算LD50，但Bliss法最為準(zhǔn)確。本試驗(yàn)利用Bliss法軟件計(jì)算醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]的LD50為10 562 mg/kg，95%可信區(qū)間為8 609.4～3 023 mg/kg，依據(jù)《我國(guó)工業(yè)化學(xué)物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》[17]，該物質(zhì)為低毒。

體質(zhì)量是反映機(jī)體發(fā)育是否正常的標(biāo)志。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在醋酸鉛急性染毒期間，小鼠體質(zhì)量變化與染毒情況關(guān)系不明顯，并沒(méi)有隨著染毒劑量的增加而發(fā)生顯著變化。臟器指數(shù)是反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器官功能是否正常的重要指標(biāo)，在毒理學(xué)試驗(yàn)中可依據(jù)化學(xué)物質(zhì)對(duì)臟器的影響初步判斷其毒性。本試驗(yàn)中，隨著醋酸鉛劑量的增加，小鼠心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)總體升高，其中以腎臟指數(shù)升高趨勢(shì)最顯著；大腦指數(shù)則降低，而肺臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的變化無(wú)明顯規(guī)律性。

大量研究表明，鉛對(duì)動(dòng)物體的損害是全身性的，其能損害多種組織和器官[18-20]。本試驗(yàn)中，醋酸鉛急性染毒后，剖檢小鼠的心臟、脾臟和腎臟有腫大充血現(xiàn)象，其他組織器官剖檢變化不明顯；病理組織學(xué)分析表明，小鼠大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟和腎臟均有病變發(fā)生，其中只有高鉛組小鼠肺組織有明顯病理變化，而低鉛組和中鉛組小鼠肺無(wú)病理變化，推測(cè)消化道染毒對(duì)小鼠肺的毒性效應(yīng)可能存在一定的制約性。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了鉛對(duì)動(dòng)物多組織、多器官均有損傷作用，這為以后研究鉛對(duì)機(jī)體整體損傷提供了依據(jù)。

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