劉 贊 于 瀅 孫明波 陳文博 戴政寧 鐘 飛 余 洋

1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測院，遼寧沈陽 110179；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽 110016

定量蛋白質(zhì)組學(xué)在納米銀材料中的研究進(jìn)展

劉 贊1于 瀅1孫明波1陳文博1戴政寧2鐘 飛2余 洋1

1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測院，遼寧沈陽 110179；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽 110016

iTRAQ是2004年開發(fā)的一種新的同位素標(biāo)記試劑，結(jié)合MRM技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、體液、微生物、人體組織和細(xì)胞等多種樣本的蛋白質(zhì)鑒定、定量以及對目的蛋白的驗(yàn)證中。目前，由于iTRAQ能同時(shí)對2-8組樣品進(jìn)行標(biāo)記分析并具有高通量、重復(fù)性、敏感性高等特點(diǎn)使其為進(jìn)行納米銀生物醫(yī)學(xué)材料毒性評估提供了有力的技術(shù)平臺。

同位素相對與絕對定量技術(shù)；多反應(yīng)監(jiān)測；納米銀；蛋白質(zhì)

近年來研究蛋白質(zhì)相對和絕對定量的常用質(zhì)譜分析技術(shù)是同位素標(biāo)記，如2004年開發(fā)的較新的技術(shù)iTRAQ等。采用i-TRAQ進(jìn)行蛋白質(zhì)的相對和絕對定量，其結(jié)果可以得到500～600種蛋白。通過大規(guī)模數(shù)據(jù)分析，采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）對篩選出來的蛋白進(jìn)行確證。MRM技術(shù)是一種基于已知信息或假定信息有針對性地獲取數(shù)據(jù)，進(jìn)行質(zhì)譜信號采集的技術(shù)。目前，它已經(jīng)成為生物標(biāo)志物大規(guī)模臨床確診的主要手段。未來，iTRAQ結(jié)合MRM在探求未知復(fù)雜疾病領(lǐng)域中將成為一種有效性和可靠性較高的技術(shù)[2]。

納米技術(shù)是在0.1～100 nm空間尺度內(nèi)操縱原子和分子，研究物質(zhì)的特性和相互作用，并利用這些特性的多學(xué)科交叉的一門綜合性科學(xué)技術(shù)[3-4]。然而，如何評價(jià)納米材料的毒性和安全性還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。我國食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)道，到目前為止我國已有188件國產(chǎn)納米醫(yī)療器械和6件進(jìn)口納米醫(yī)療器械通過了國家局或省級藥監(jiān)局的審批進(jìn)行臨床應(yīng)用[5]。迄今，有關(guān)納米銀對人體的負(fù)效應(yīng)，尤其是長期頻繁或大量使用時(shí)的慢性毒性尚不清楚。因此，建立完善的既符合我國特點(diǎn)又與國際接軌的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系，保證其安全使用是至關(guān)重要的。

綜上，該文就iTRAQ結(jié)合MRM技術(shù)及其在納米生物醫(yī)學(xué)材料毒性評估中的現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 iTRAQ技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域

1.1 iTRAQ技術(shù)特點(diǎn)

在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)標(biāo)記2～8個(gè)樣品，一次實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)多達(dá)8個(gè)樣品的蛋白質(zhì)鑒定和定量，定性與定量同時(shí)進(jìn)行；適用范圍較廣；所需樣品較少，可處理微量樣品；13C，15N，18O在 scx或RP預(yù)分離時(shí)，不會(huì)影響肽段的行為，任意肽段理論上都可能被標(biāo)記，擁有極高的標(biāo)記效率；每個(gè)蛋白都有多個(gè)肽段被標(biāo)記，提高了鑒定和定量可靠性；平衡集團(tuán)在質(zhì)譜碎裂時(shí)會(huì)中性丟失，不爭奪電荷，鑒定時(shí)，來源于不同樣品的報(bào)告集團(tuán)會(huì)分離得很清楚(113-121Da，skip120)，而來源于不同樣品的相同肽段在質(zhì)譜上表現(xiàn)為一同個(gè)峰，強(qiáng)度疊加可有效改善圖譜鑒定，有利于鑒定。

1.2 iTRAQ的應(yīng)用領(lǐng)域

iTRAQ試劑可用于標(biāo)記不同性質(zhì)的樣品，如微生物(500 mg），動(dòng)物組織(500 mg）[6]，植物組織(500 mg）[7]，細(xì)胞(106～107)，體液(羊水，腦脊液，尿液等)，血清/血漿(200～300 μl)，細(xì)胞器[8]。iTRAQ技術(shù)不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，它可以檢測出低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、＜10 KD或＞200 KD的蛋白；可以進(jìn)行多個(gè)時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測；可以分析詳細(xì)分期／型的臨床疾病樣本，并可設(shè)計(jì)樣本重復(fù)；甚至可以進(jìn)行個(gè)體樣本的研究、細(xì)胞周期、細(xì)胞信號傳導(dǎo)整個(gè)過程的蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。在差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，iTRAQ技術(shù)可用來尋找生物標(biāo)志物，進(jìn)行時(shí)間過程樣本分析，不同處理方法樣本差異以及信號通路的研究。

2 MRM技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 MRM技術(shù)特點(diǎn)

(1)靈敏度高：通過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標(biāo)檢測物的信噪比顯著提高，從而實(shí)現(xiàn)檢測的高靈敏度。(2)重現(xiàn)性好：在MRM技術(shù)選擇性的質(zhì)譜信號采集中，避免了待測分子離子化、質(zhì)譜信號的抑制及源內(nèi)碰撞碎裂過程的影響，因此重現(xiàn)性也相應(yīng)提高。(3)準(zhǔn)確度高：利用MRM技術(shù)的特異性，進(jìn)行連續(xù)增強(qiáng)的離子掃描分析，得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)碎片數(shù)據(jù)，與全掃描和中性丟失質(zhì)譜掃描模式相比降低了分析過程中定性結(jié)果的假陽性率，保證了分析的準(zhǔn)確度。(4)通量高：使用目前最先進(jìn)的質(zhì)譜系統(tǒng)，MRM技術(shù)每個(gè)工作循環(huán)能處理多達(dá)300對母離子-子離子對，這種特點(diǎn)為研究多種蛋白質(zhì)的多種修飾和豐度變化提供了機(jī)會(huì)，更能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需求。

2.2 MRM的應(yīng)用領(lǐng)域

生物標(biāo)志物的研究是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前，標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)-驗(yàn)證-臨床確證的研究模式已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可。即在發(fā)現(xiàn)階段從疾病組織中尋找與正常組織的差異蛋白質(zhì)到到驗(yàn)證階段使用MRM技術(shù)進(jìn)行臨床確證。MRM技術(shù)在驗(yàn)證和確證階段都彌補(bǔ)了經(jīng)典免疫學(xué)原理利用抗體進(jìn)行驗(yàn)證確證的缺點(diǎn)，充分體現(xiàn)了該技術(shù)在生物標(biāo)志物檢測領(lǐng)域中的價(jià)值。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在許多生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)過程中起重要作用，例如，在蛋白質(zhì)磷酸化修飾中，MRM技術(shù)在翻譯后修飾的研究領(lǐng)域中顯示了獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)勢磷酸化蛋白質(zhì)被酶切后，磷酸化多肽的信號淹沒在大量非磷酸化多肽的信號中需要進(jìn)行磷酸化富集來提高分析靈敏度，改善分析效果。MRM技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用上也展現(xiàn)了其方法的優(yōu)點(diǎn)。首先，在一定程度上提高了測定的動(dòng)態(tài)范圍其原因一方面是因?yàn)閷﹄x子的選擇檢出，降低了復(fù)雜組分的背景信號，增加了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度；另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質(zhì)MR離子對的選擇來均衡兩者的響應(yīng)信號差異。例如，對高豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)豐度較低的母離子-子離子對；對低豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)程度較高的母離子-子離子對，從而均衡高、低豐度的信號差異。其次，減少了復(fù)雜組分流產(chǎn)物的干擾，增強(qiáng)了檢測的特異性。此外，MRM技術(shù)高通量的特點(diǎn)，也為多種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量提供了條件[9]。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在的納米銀材料中的研究進(jìn)展

徐麗明等[10]早在2011年就已經(jīng)進(jìn)行了納米銀離子毒性評估的全基因組進(jìn)行了研究，該結(jié)果表明，與納米銀接觸24 h的Hela細(xì)胞中上調(diào)的基因涉及各種初級代謝過程，細(xì)胞進(jìn)程和應(yīng)激反應(yīng)，這些基因的上調(diào)可歸因于銀離子的釋放。而納米銀所致的基因下調(diào)也可歸因于銀離子的釋放，但基因下調(diào)中大多數(shù)功能的改變要?dú)w結(jié)于納米銀本身。而接觸48 h后基因改變的數(shù)目大幅下降，提示毒性反應(yīng)是順時(shí)的。然而，隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn)，生命科學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時(shí)代，在這個(gè)時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個(gè)物種的基因組被測序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達(dá)序列分析(Serial analysis of gene expression，SAGE)等，都是從細(xì)胞中mRNA的角度來考慮的，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。但事實(shí)并不完全如此，從DNA mRNA蛋白質(zhì)，存在三個(gè)層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(Transcriptional control)，翻譯水平調(diào)控(Translational control)，翻譯后水平調(diào)控(Post-translational control)。從mRNA角度考慮，實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)組與基因組的有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以有多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾，故一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時(shí)可以超過基因組的數(shù)目。

目前，在納米銀材料的研究中，Verano-Braga T[11]等人使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究納米銀離子引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，結(jié)果表明，一些獨(dú)特的細(xì)胞進(jìn)程是由納米顆粒的粒徑大小決定的。如，100 nm粒徑的納米銀粒子是通serine/threonine protein kinase (PAK)，mitogen-activated protein kinase(MAPK)和phosphatase 2A pathways信號轉(zhuǎn)到路徑引發(fā)的直接效應(yīng)，而20 nm粒徑的納米銀粒子則直接誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，包括產(chǎn)生的活性氧和羰基化蛋白。此外，研究者還報(bào)道了有相關(guān)蛋白在給與20 nm粒徑的納米銀顆粒之后呈明顯上調(diào)并參與相撲化途徑 (SUMOylation pathway).Mirzajani F[12]等人利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了納米銀顆粒對水稻的毒性，研究表明，已鑒定出的蛋白參與氧化應(yīng)激耐受、Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞壁和DNA/RNA/蛋白質(zhì)的直接損傷，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂。Rainville LC[13]等利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對檸檬酸包被的納米銀離子的毒性進(jìn)行了評估，其結(jié)果表明了兩種化合物之間的功能重疊，卵黃蛋白的一個(gè)最確定的特性是起應(yīng)力傳感器的作用。此外，相對于卵黃蛋白而言，當(dāng)AgNO3誘導(dǎo)14-3-3蛋白發(fā)生羥基化反應(yīng)時(shí)，血紅蛋白水平由于AgNP的暴露升高。該研究證實(shí)了以前觀察到的納米銀粒子的急性毒性低，同時(shí)表明，銀的兩種形式的毒性隨不同生物的途徑，可能導(dǎo)致與水環(huán)境中的天然化合物或污染物的相互作用。

4 結(jié)語

目前，國內(nèi)外納米銀材料的生物學(xué)制品尚無完善的評估體系，如果能夠基于iTRAQ技術(shù)結(jié)合MRM技術(shù)發(fā)現(xiàn)并確證有效的納米銀材料對于人體毒性的生物標(biāo)志物，將極大程度地推進(jìn)納米銀醫(yī)用生物材料的評估體系建立。iTRAQ技術(shù)可對2～8個(gè)不同的樣本同時(shí)分析，相比較于目前蛋白質(zhì)組學(xué)的其他方法有著不可比擬的優(yōu)勢，通過iTRAQ技術(shù)對納米銀材料進(jìn)行的全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，良好的重復(fù)性、可信性以及敏感性，其結(jié)合MRM技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的生物標(biāo)志物的驗(yàn)證和臨床確證都證明了該兩項(xiàng)技術(shù)的結(jié)合將會(huì)在納米銀生物醫(yī)學(xué)材料毒性的評估方面有所作為。當(dāng)然，iTRAQ技術(shù)并非完美，因?yàn)?，在同位素進(jìn)行標(biāo)記的同時(shí)就已經(jīng)改變了檢測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這或多或少的會(huì)造成樣本的誤差。但是，我們有理由相信，隨著iTRAQ技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它不僅僅只限于在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮作用，其與MRM的結(jié)合在納米銀生物醫(yī)學(xué)材料的毒性評估中極有可能發(fā)揮重要作用，從而實(shí)現(xiàn)納米銀材料評估歷史上零的突破及質(zhì)的飛越。

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正文主體部分之“討論”

1.著重討論研究結(jié)果的創(chuàng)新之處及從中導(dǎo)出的結(jié)論，包括理論意義、實(shí)際應(yīng)用價(jià)值、局限性，及其對進(jìn)一步研究的啟示等。如果不能導(dǎo)出結(jié)論，也可通過討論，提出建議、設(shè)想、改進(jìn)意見或待解決的問題等。

2.應(yīng)將本研究結(jié)果與其他有關(guān)的研究相比較，并將本研究結(jié)論與目的聯(lián)系起來討論。

3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結(jié)果部分詳述過的數(shù)據(jù)或資料。不應(yīng)列入圖或表。

Advances of Quantitative Proteomics in Nano-silver Material

LIU Zan1YU Ying1SUN Mingbo1CHEN Wenbo1DAI Zhengning2ZHONG Fei2YU Yang1
1.Liaoning Medical Device Test Institute,Shenyang,Liaoning Province,110179,China;2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang,Liaoning Province,110016,China

Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)is a new isotope labeling reagent developed in 2004,which combined with multiple reactions monitoring (MRM),has been applied to the identification and quantification and verification of the target proteins in a wild range of biological samples,including bacterial,yeasts,body fluid,microorganism,human tissues,and cell.As a new method of quantitative proteomics so far,the technique of iTRAQ allows for the quantitative analysis of 2-8 samples simultaneously and displays its advantages of high throughput,repeatability and high sensitivity.It also provides a potential technology platform for evaluation the toxicity of nano-sliver biomedical materials.

iTRAQ;MRM;Nano-silver;Protein

R341

A

1674-0742（2014）12（b）－0196-03

2014-09-01）

課題名稱：新型及高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械檢測與安全價(jià)技術(shù)評價(jià)（2012BAI22B01）。

劉贊（1976-），女，遼寧沈陽人，博士，助理工程師，主要從事肺腺癌的發(fā)病機(jī)制研究及早期血清標(biāo)志物探測.

余洋，（1976-），女，遼寧沈陽人，碩士，副主任藥師，主要從事醫(yī)療器械的生物學(xué)檢測工作。