楊從戎, 苗 亮, 李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

黑鯛(Sparusmacrocephalus)屬鱸形目(Perciformes)、鯛科(Sparidae)、鯛屬(Sparus)，俗稱黑加吉、黑鰍、黑立，多棲息于泥沙底質(zhì)或巖礁聚集的淺海岸邊，屬暖水性底層魚，分布于中國、日本沿海及朝鮮半島。黑鯛食性雜、生長迅速、抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)，適合沿海網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖，加上其肉質(zhì)與口感極佳、營養(yǎng)豐富、適宜垂釣，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，因此具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。20世紀(jì)末，由于黑鯛育苗試驗(yàn)的成功，在中國沿海各地，黑鯛養(yǎng)殖得到了快速發(fā)展，逐漸成為國內(nèi)一種重要的海水養(yǎng)殖品種[1]。目前，有關(guān)黑鯛的研究主要集中在繁育和養(yǎng)殖等方面[2-5]，而有關(guān)黑鯛同工酶方面的研究僅見王可玲等[6]對黑鯛等5種海水魚同工酶表達(dá)的簡單分析，但未對黑鯛同工酶的組織表達(dá)差異做詳盡描述。

同工酶(isozyme)是指由一個或多個基因座位編碼、催化同一生化反應(yīng)、在電場中的運(yùn)動存在多種可分離形式的酶[7]，同工酶分析是研究生物生化遺傳特征的主要方法之一。目前已對多種魚類進(jìn)行了同工酶分析[8]，研究的同工酶種類也較多，其中在生理學(xué)和組織特異性研究方面，多使用乳酸脫氫酶(LDH)、醇脫氫酶(ADH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、半乳糖脫氫酶(GAD)、甲酸脫氫酶(FDH)等同工酶進(jìn)行分析和比較[9, 10]。

筆者分析了上述9種同工酶在黑鯛不同組織中的表達(dá)情況，以期為黑鯛的生化遺傳分析、種質(zhì)資源保護(hù)等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品制備

實(shí)驗(yàn)用黑鯛購自浙江省寧波市路林水產(chǎn)市場，共10尾，平均體重482 g，斷尾放血后立即在冰上解剖，取眼睛、鰓、腦、心、腎、脾、肝、腸和肌肉等9種組織，按1∶ 3的比例(W/V)加入pH值7.0，0.1 mol/L的PBS，冰浴條件下充分勻漿后以15 000 r/min低溫(4℃)離心30 min(部分組織須多次離心至酶液澄清)。吸取上清酶液，加入等體積的40%甘油及1/10體積的0.1%溴酚藍(lán)電泳指示劑后電泳分析。

1.2 電泳、染色

實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法，其中濃縮膠pH值為6.8，濃度為3.6%；分離膠pH值為8.8，濃度為8.2%。電極緩沖液為pH值8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。電泳在冰浴中進(jìn)行，起始電壓為150 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶進(jìn)入分離膠后，將電壓升高至350 V。約2 h后，待指示帶至玻璃板底部2～3 cm處，結(jié)束電泳，立即進(jìn)行染色。染色參考王中仁[11]的方法進(jìn)行，略加修改，之后用7.5%冰醋酸溶液終止染色并固定，掃描儀掃描、記錄。

1.3 結(jié)果記錄

染色后的凝膠經(jīng)7.5%冰乙酸溶液脫色固定后凝膠成像，記錄酶帶的遷移距離和顏色深度。同工酶的縮寫、命名采用胡能書等[12]的方法，從陰極到陽極依次命名為1,2,3…。

2 結(jié)果

2.1 乳酸脫氫酶(LDH E.C.1.1.1.27)

由圖1可見，黑鯛的9種組織中均有LDH表達(dá)，共檢測到15條酶帶。其中眼和腦條帶復(fù)雜，有多條特異表達(dá)的條帶；肌肉有3條帶，其余組織均為1條帶；心臟中LDH活性最高，肝臟中活性最低(圖1)。

圖1 黑鯛不同組織LDH圖譜

2.2 醇脫氫酶(ADH E.C.1.1.1.1)

ADH是一種催化醇脫氫形成醛或酮的酶，一般為二聚體酶，在黑鯛各組織中共表現(xiàn)出4個條帶。Adh-1在各組織中均有檢出，為基礎(chǔ)性表達(dá)；Adh-2，Adh-3在眼、鰓、腎、脾、肝和腸道6個組織中表達(dá)，表現(xiàn)出二聚體特性；Adh-4只在眼睛中特異表達(dá)(圖2)。

2.3 蘋果酸脫氫酶(MDH E.C.1.1.1.37)

在黑鯛組織中可以檢測到上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)兩種類型的蘋果酸脫氫酶。m-MDH更靠近陰極，主要在鰓、腦、心、腎和肝中表達(dá)，但活性較弱。s-MDH靠近陽極，其中 s-Mdh-1在9個組織中都有表達(dá)，肝和腸中活性最強(qiáng)；s-Mdh-2只在肌肉和心臟中表達(dá)。9種組織中， s-MDh的活性高于m-MDh(圖3)。

圖2 黑鯛不同組織ADH圖譜

圖3 黑鯛不同組織MDH圖譜

2.4 蘋果酸酶(ME E.C.1.1.1.40)

ME在黑鯛9種組織中共檢測到4個條帶。其中Me-1和Me-2只在腎、肝、腸中特異性表達(dá)，活性較弱；而Me-3和Me-4在各組織中都有表達(dá)，肝臟中活性最強(qiáng)，眼中活性最弱(圖4)。

圖4 黑鯛不同組織ME圖譜

2.5 超氧化物歧化酶(SOD E.C.1.15.1.1)

黑鯛的9個組織中SOD均有4條酶帶，分為上清液型(s-SOD)和線粒體型(m-SOD)兩種。 m-SOD為一條酶帶；s-SOD為二聚體酶，由3個基因座位編碼，表現(xiàn)為3條靠得很近的酶帶(圖5)。

2.6 過氧化物酶(POD E.C.1.11.1.7)

黑鯛眼、腦、肌肉和腸中均未檢測到POD條帶。其余5個組織中共出現(xiàn)5個條帶，為單體或二聚體；其中Pod-1—Pod-4在這5個組織中都有表達(dá)，但活性差異較大；脾中活性最強(qiáng)，肝中活性最低；而Pod-5只在心臟中表達(dá)(圖6)。

圖6 黑鯛不同組織POD圖譜

2.7 酯酶(EST E.C.3.2.1.1)

黑鯛的EST表型較復(fù)雜：心臟和肌肉組織中未檢測到條帶；在眼、鰓、腦中出現(xiàn)2～3個微弱條帶；在腎、脾、肝、腸4個組織各有5～10個條帶，其中腎和腸中條帶最多；活性也是腎和腸中明顯強(qiáng)于其他組織。(圖7)。

圖7 黑鯛不同組織EST圖譜

2.8 半乳糖脫氫酶(GAD E.C.1.1.1.48)

黑鯛9種組織中均有GAD表達(dá)，共出現(xiàn)4條酶帶。其中Gad-1、Gad-3、Gad-4在各組織中都有表達(dá)；Gad-2條帶僅在肝臟中表達(dá)；肌肉中GAD活力明顯弱于其他組織(圖8)。

2.9 甲酸脫氫酶(FDH E.C.1.2.1.2)

黑鯛的FDH為二聚體酶，9個組織共有6條酶帶，其中僅Fdh-2為基礎(chǔ)表達(dá)，在9個組織中都有條帶且活性差異不大；其余均為組織特異表達(dá)：Fdh-1僅在肝中表達(dá)，F(xiàn)dh-3在腎和腸中表達(dá)，F(xiàn)dh-4僅在腎中表達(dá)；Fdh-5、Fdh-6僅在眼中表達(dá)(圖9)。

圖8 黑鯛不同組織GAD圖譜

圖9 黑鯛不同組織FDH圖譜

3 討論

3.1 黑鯛同工酶表達(dá)的組織特異性

本文研究結(jié)果顯示黑鯛具有較為完善的同工酶系統(tǒng)，這使得黑鯛對各種生存條件具有較好的適應(yīng)性。機(jī)體在發(fā)育過程中各組織分化，導(dǎo)致了不同組織同工酶的特異性表達(dá)，從而能滿足不同組織特定的生理功能。9種同工酶在不同組織中的表達(dá)差異詳見表1。由表1可見9種同工酶按其生理功能在不同組織中表達(dá)活性和條帶數(shù)量各有所不同。

LDH是一種糖酵解酶，主要與乳酸的產(chǎn)生和利用有關(guān)。肌肉是機(jī)體無氧代謝較為旺盛的組織，黑鯛肌肉中LDH表現(xiàn)出3條酶活較強(qiáng)的條帶，主要作用是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，參與無氧代謝；心臟中LDH酶活最高，這是因?yàn)長DH還能催化乳酸氧化形成丙酮酸，參與有氧代謝。LDH在肌肉和心臟中大量表達(dá)的情況與金春華等[13]對大彈涂魚LDH研究結(jié)果相一致。一般認(rèn)為C基因控制的LDH表型在部分魚類的眼和肝臟中表達(dá)[9]，而這與黑鯛眼組織中特異的Ldh-15條帶對應(yīng)。同時在黑鯛腦組織中，存在數(shù)量較多且活性較弱的大量條帶，可能是由于有副帶或?qū)嶒?yàn)誤差的原因，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。ADH也是種無氧代謝相關(guān)的酶，在缺氧的情況下可將體內(nèi)多余的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇，從而避免機(jī)體因丙酮酸積累而中毒死亡。在黑鯛各組織中，心臟ADH酶活最強(qiáng)，這與黑鯛較強(qiáng)的耐低氧能力相一致。

表1 黑鯛9種組織9種同工酶活力與條帶數(shù)量比較

注：“+++”：活性強(qiáng)；“++”：活性較強(qiáng)；“+”：有活性條帶不清晰；“***”：條帶數(shù)量多；“**”：條帶數(shù)量較多；“*”：較少或一個條帶；“-”：無條帶或無活性。

MDH和ME是生物氧化的重要酶類，分別負(fù)責(zé)草酰乙酸和蘋果酸的相互轉(zhuǎn)化以及蘋果酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸過程。黑鯛的MDH為二聚體，分為上清液型和線粒體型，兩種類型的酶分別由兩種基因座位編碼，在臟和腸組織中活性最高。ME是四聚體酶，由4個基因座位編碼，同樣也在肝和腸組織中活力最強(qiáng)。

SOD、POD、EST這3種酶與機(jī)體的免疫解毒功能密切相關(guān)。黑鯛SOD同工酶表型特征為在各組織中皆有表達(dá)，且酶活較強(qiáng)。李明云等[14]在香魚的研究中發(fā)現(xiàn)SOD在脾臟和肝臟的活性較強(qiáng)，而肌肉等組織中未見表達(dá)，這種表達(dá)差異可能和兩者生存環(huán)境以及生物學(xué)特性有關(guān)。POD能利用過氧化氫氧化嘌呤、酚類和胺類等有毒物質(zhì)，以減輕這類物質(zhì)對機(jī)體的毒害作用[15]，黑鯛的POD在脾中有大量表達(dá)，預(yù)示著脾組織中存在著較強(qiáng)的和過氧化氫氧化相關(guān)的免疫代謝。EST是一種水解酶，主要作用催化脂類水解。黑鯛的腎臟和腸道中存在大量EST的表達(dá)，與酯酶主要參與解毒與消化功能相關(guān)。GAD與FDH在黑鯛各組織中表現(xiàn)出各組織中皆有表達(dá)且活性較弱的特性，這可能與這2種同工酶所控制的甲酸代謝和半乳糖代謝在黑鯛體內(nèi)代謝水平較低有關(guān)。

3.2 眼和腸組織中的同工酶表達(dá)特性及生理意義

眼是魚類視覺的感覺器官，雖然不參與體內(nèi)其他生命活動，但對生物體意義重大；在同工酶表達(dá)上，也存在一定的特異表達(dá)，例如在大部分魚的眼組織中存在特異的C基因控制的LDH表型[9]。黑鯛眼組織同工酶表達(dá)特征是同一種同工酶具有多種表達(dá)，但活性不高，例如ADH和LDH圖譜中，眼都是條帶數(shù)量最多的組織，但酶活不是最強(qiáng)。分析其原因，可能因?yàn)檠凼潜┞对隗w表的器官，增加了外界病原體侵襲和環(huán)境刺激的機(jī)會，且眼組織比較敏感，因此這種同工酶表達(dá)特性，有助于眼組織及時處理各種應(yīng)激，確保眼功能的穩(wěn)定。

硬骨魚類腸組織主要負(fù)責(zé)消化功能，但由于本身沒有腸腺，只有依靠腸本身的上皮細(xì)胞分泌酶類參與消化，因此腸道中自身分泌著大量消化酶參與食物的消化和吸收。此外，腸組織還具有免疫功能，例如免疫屏障(免疫活性細(xì)胞、抗體系統(tǒng)等)、生物屏障(正常菌群共生)、化學(xué)屏障(胃酸及糖蛋白等)、物理屏障(粘液、吸附、再生、運(yùn)動)，因此實(shí)際上腸組織是硬骨魚類最大最復(fù)雜的免疫器官[16]。在同工酶研究中，一般以眼睛、肌肉、鰓、心臟、肝臟、腎臟和脾等組織作為研究對象[6,13]，對腸組織的同工酶研究鮮有報(bào)道。管丹東[17]和董旭輝[18]對大黃魚和鬼鮋進(jìn)行同工酶研究時對腸組織進(jìn)行過取樣檢測，但未系統(tǒng)分析腸組織同工酶表達(dá)特性。本實(shí)驗(yàn)對黑鯛腸組織的同工酶表達(dá)模式作了較為詳細(xì)的研究。結(jié)果顯示在所詳細(xì)研究的9種同工酶中，除了POD外，其他8種同工酶在腸組織中都有表達(dá)，且活性很強(qiáng)。腸組織相比其他組織，具有更為完善的同工酶系統(tǒng)，這正和腸組織消化吸收以及免疫等重要的生理功能相適應(yīng)，說明腸組織中存在著較為旺盛的代謝活動。該研究結(jié)果可為黑鯛等魚類腸組織功能及其相關(guān)的研究提供參考。

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