洪 偉， 薛正蓮

(1. 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心， 蕪湖 241000；2.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院， 蕪湖 241003)

乳酸菌是益生菌的重要內(nèi)容，主要包括乳球菌、明串珠菌、片球菌、乳桿菌和肉食桿菌等[1]。植物乳桿菌是乳酸菌中的一種，常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中，多數(shù)是從植物中分離得到，故命名為植物乳桿菌[2]。植物乳桿菌在食品生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要的作用，目前，應(yīng)用于很多發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，如奶酪、干制發(fā)酵香腸、酸面團面包等[3-4]。乳酸菌作為一種益生菌，不僅具有提高食品的營養(yǎng)價值，改善食品風(fēng)味，延長食品保存時間的功能，而且對人體有多方面的保健作用[5-8]。

植物乳桿菌通過與病原菌對限制性營養(yǎng)素能力競爭，來抑制病原菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)組成，形成生物學(xué)屏障[9-11]。很多植物乳桿菌的抑菌譜已經(jīng)報道，如楊瑾用植物乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對l6個指示菌進(jìn)行抑菌測定，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌素對革蘭氏陽性、陰性致病菌均有較好的抑菌效果[12]。

除了細(xì)菌素共有的易被酶分解、無抗藥性等特性外，迄今報道過的大部分植物乳桿菌細(xì)菌素均具有很好的熱穩(wěn)定性，在食品加工過程中可避免加熱滅菌所引起的失活。單春喬等在121℃處理20 min 后，以大腸埃希菌為指示菌作抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌活性達(dá)到80%以上，并且隨溫度升高，其抑菌活性變化不大，表明嗜酸乳桿菌的細(xì)菌素對溫度具有較好的穩(wěn)定性[13]。范小兵等的研究表明，抑菌活性受pH值的影響較大，pH 值對細(xì)菌素抑菌活性的影響表現(xiàn)為大部分嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的耐酸性強，在pH值較低的情況下抑菌效果明顯[14]。

植物乳桿菌大都分離自發(fā)酵類食品中，具有可食用植物源性，充分保證了其所產(chǎn)生的細(xì)菌素在食品中應(yīng)用的安全性。中國植物乳桿菌資源豐富，這有利于該菌種資源和有益代謝產(chǎn)物的開發(fā)。因此，植物乳桿菌有著非常廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。當(dāng)前，對植物乳桿菌的抑菌作用報道甚少，更是鮮見關(guān)于該菌對溫度的穩(wěn)定性，pH值的耐受性及其酶的敏感性等生物學(xué)特性的報道。本文對分離自市售腌漬蔬菜的一株植物乳桿菌菌株進(jìn)行抑菌性試驗，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步研究開發(fā)具有天然食品防腐劑前景的植物乳桿菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)分離自市售腌漬蔬菜，菌株編號為W5，現(xiàn)保存于蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系實訓(xùn)中心。

1.1.2 實驗指示菌

9種指示菌分別為：大腸桿菌(Escherichiacoli)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellatyphimunius)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)檸檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicillium)及黑曲霉(Aspergillusniger)。由安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供。

1.1.3 試劑

蛋白酶、過氧化氫酶購自于 AMRESCO 公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶購自于BIOSHARP 公司。

培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

MRS 培養(yǎng)基(1L)：蛋白陳 10 g、牛肉膏 10 g、酵母粉 5 g、葡萄糖 20 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉 5 g、 K2HPO42 g、 MgSO4· 7H2O 0.58 g、MnSO4· 4H2O 0.25 g、Tween-80 1 mL，蒸餾水定容，置于高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌 20 min。

LB培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容。分裝于三角瓶內(nèi)，密封。置于高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌 20 min。

SDAY培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10 g、酵母粉10 g、葡萄糖40 g、瓊脂15 g。稱量好上述物質(zhì)，放入水中攪拌煮沸充分溶解分裝至中號試管包扎，置于高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌 20 min。

PDA培養(yǎng)基(1L)：馬鈴薯200 g(去皮，切成小塊煮沸20 min，紗布過慮)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容。分裝后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培養(yǎng)

將凍干的植物乳桿菌接種于無菌生理鹽水中，用涂板、劃線法純化菌株，把目的菌株轉(zhuǎn)接到液體MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到液體菌種備用[15]。

1.2.2 指示菌制備[16]

大腸桿菌、藤黃微球菌、雞白痢沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌采用LB培養(yǎng)基接種，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h左右，涂布培養(yǎng)法測其菌液濃度，用無菌生理鹽水稀釋成107個/mL菌懸液。青霉和黑曲霉則采用SDAY培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)36 h。釀酒酵母采用PDA培養(yǎng)基，在28℃恒溫培養(yǎng)36 h。指示菌均4℃冰箱保存待用。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

將植物乳桿菌菌種以1%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基，在37℃下厭氧培養(yǎng)48 h，10000 r/min 離心 10 min，收集上清液濃縮10倍后待用。

1.2.4 抑菌實驗

采用稍加改進(jìn)牛津杯瓊脂擴散法[17]：取70 μL的各指示菌加入到8 mL的上層培養(yǎng)基中，振蕩混勻，然后倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有10 mL底層培養(yǎng)基的平板上。靜置放置15 min，讓牛津小杯自然沉降。然后向牛津小杯中加入150 μL的待測樣品。4℃冰箱擴散4 h，然后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，游標(biāo)卡尺十字相交法測抑菌圈直徑。

1.2.5 菌株生物學(xué)特性研究

對溫度的穩(wěn)定性： 將發(fā)酵液在121℃高壓鍋內(nèi)處理20 min，對照CK不經(jīng)過高溫處理，分別以大腸桿菌、檸檬色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗。

對pH值的耐受性：用1 mol/L的HCI和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗，以相同pH值的生理鹽水作為對照。觀察抑菌圈大小的變化，每處理3個重復(fù)。

對酶的敏感性[18]：分別取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶20 mg加入到20 mL滅菌過的超純水中，配制成1 mg/mL，均保存于-20℃，備用。將發(fā)酵上清液與酶液等體積混合，置于37℃下反應(yīng)30 min。以大腸桿菌為指示菌，分別觀察添加酶液前后抑菌圈大小的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS(2001)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果經(jīng)方差分析后進(jìn)行Duncan′s 多重比較檢驗各處理間的差異顯著性(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑的測量

表1 乳酸菌發(fā)酵液的抑菌譜

注：表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著，小寫字母表示0.05水平上的差異顯著水平，大寫字母表示0.01水平上的差異顯著水平。下表同。

從表1中數(shù)據(jù)可知，9種指示菌中，該植物乳桿菌對6種具有抑制作用。植物乳桿菌發(fā)酵液能較強的抑制大腸桿菌、檸檬色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌等指示菌。而對釀酒酵母、青霉和黑曲霉3種真菌類指示菌不具有抑菌效果，因而，該植物乳桿菌具有廣泛的抑菌譜。

2.2 對溫度的穩(wěn)定性

發(fā)酵上清液在121℃條件處理20 min抑菌活性有所降低，但依然保留較高活性，仍具有明顯的抑菌活性，對大腸桿菌、檸檬色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小分別為26.25 mm、23.28 mm、24.62 mm和20.68 mm。說明高溫不會破壞代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)，表明該植物乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性，這一性質(zhì)與已報道的嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性相似[13](表2)。

表2 不同溫度下的抑菌圈直徑

2.3 對pH值的耐受性

經(jīng)試驗，對照1 mol/L的HCI對指示菌并沒有抑制作用，由此可知，發(fā)揮抑菌作用的是該植物乳桿菌。由圖1 結(jié)果表明，在pH值在2～8之間抑菌作用均很穩(wěn)定，在pH值為6時，抑菌活性最強，但隨著pH值增大，抑菌作用有不斷下降的趨勢。

圖 1 pH值對植物乳桿菌的抑菌作用的影響

注：柱形圖上端的字母表示各pH值抑菌差異程度，相同字母差異不顯著，不同字母差異顯著(鄧肯式新復(fù)極差檢測,P< 0.05)。

2.4 對酶的敏感性

由表3結(jié)果可得，該植物乳桿菌對蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶均敏感，處理后的抑菌直徑分別為3.36 mm、2.42 mm和2.34 mm，幾乎被完全降解。但對過氧化氫酶的敏感性則較低，用過氧化氫酶處理和未做處理的上清液的抑菌圈大小基本一致，排除過氧化氫所起的抑菌作用的干擾，發(fā)酵上清液中存在其它具有抑菌作用的物質(zhì)。

表3 不同酶處理前后抑菌圈直徑的大小

3 討論

隨著經(jīng)濟與社會的不斷發(fā)展及人們生活水平的不斷提高，人們對綠色食品、健康食品有了新的認(rèn)識和要求[19]。當(dāng)前對乳酸桿菌類抑菌物質(zhì)的研究不斷深入，與本文所得類細(xì)菌素粗品性質(zhì)類似抑菌物質(zhì)也有相關(guān)報道，但多對于革蘭氏陽性菌有抑菌活性[20]。本試驗結(jié)果表明，該植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)對大腸桿菌、檸檬色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌等指示菌都有明顯的抑菌作用，因此抑菌物質(zhì)有較廣的抑菌譜，能對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有抑制作用。這一結(jié)果為細(xì)菌素在食品防腐劑工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了保障和依據(jù)。

生化特性研究主要包括對溫度的穩(wěn)定性、對pH值的耐受性及對酶的敏感性。結(jié)果表明，該植物乳桿菌具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在121℃下處理20 min仍具有較好的抑菌活性；同時植物乳桿菌在pH值2～12條件下，都具有抑菌活性，其中在pH值為6時抑菌活性最強，說明該菌株具有較廣的酸堿抑菌譜；此外，該細(xì)菌素對蛋白酶K、胰蛋白酶以及胃蛋白酶均敏感，但對過氧化氫酶不敏感。這些良好的生化特性為植物乳桿菌的進(jìn)一步的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

下一步將在選育抑菌活性強和生物學(xué)性狀優(yōu)良的植物乳桿菌菌株的基礎(chǔ)上，對該菌的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行研究；面對該菌發(fā)酵液中活性成分、代謝途徑、作用機制將是今后的研究重點。只有這樣才能更加深入地開發(fā)與應(yīng)用植物乳桿菌。

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