譚樹華，劉雨芳,*，孫遠(yuǎn)東，肖璐，李菲，桂芳艷，劉文海，戈峰

1. 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 園藝作物病蟲害治理湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湘潭411201 2. 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101

水稻是受害蟲侵襲最為嚴(yán)重的糧食作物，選育抗蟲水稻是防治害蟲最經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前,應(yīng)用于植物抗蟲性改良的外源基因主要是編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthringiensis)殺蟲晶體蛋白基因(Bt基因)，已獲得的轉(zhuǎn)Bt抗蟲植物有水稻、玉米、棉花、番茄等50 多種，其中轉(zhuǎn)Bt棉花在我國已大面積種植[1]。已有大量研究報(bào)道轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)靶標(biāo)害蟲有顯著的殺蟲效果[2-5]，對(duì)土壤微生物組成及酶活性[6]、稻田節(jié)肢動(dòng)物群落多樣性[7,8]、非靶標(biāo)生物[9,10]沒有明顯影響。轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac融合Bt基因水稻華恢 1號(hào)(HH1)作為首批獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)安全證書(農(nóng)基安證字(2009)第072號(hào))的轉(zhuǎn)基因水稻品種，對(duì)其生態(tài)安全性評(píng)價(jià)雖已有初步研究：如HH1對(duì)二化螟有較強(qiáng)致死力[11]、對(duì)白符跳(Folsomiacandida)存活率和繁殖率[12]與根際土壤微生物數(shù)量和種類沒有明顯影響[13]。這些均無例外地集中在轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)靶標(biāo)害蟲殺蟲有效性與對(duì)土壤生物、節(jié)肢動(dòng)物的安全性評(píng)價(jià)，尚未涉及水環(huán)境中的生物安全影響評(píng)價(jià)，不利于從整體全面評(píng)價(jià)其生態(tài)安全。

中華圓田螺(Cipangopaludinacathayensis)俗稱田螺，是淡水腹足類中的優(yōu)勢(shì)種群，也是南方稻田中常見的底棲軟體動(dòng)物，分布廣、生長迅速、食物類型多樣，能以各種藻類、水生植物、浮游植物、水體有機(jī)碎屑為食，也食輪蟲、微生物、水蚤、劍蚤等浮游動(dòng)物。它能積累用常規(guī)方法檢測(cè)不出的底泥或水中污染物,是多種污染物的生物積累者, 是環(huán)境監(jiān)測(cè)的理想生物種類[14,15]。它們?cè)谒幸苿?dòng)性小, 可以真實(shí)地反映周圍底泥的實(shí)際污染狀況[16]，是一種理想的底泥重金屬毒性和生物可給性指示生物[17]。據(jù)報(bào)道，田螺肝胰臟CAT活性的變化可作為間接檢測(cè)環(huán)境的污染程度的指標(biāo)[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)以中華圓田螺為對(duì)象，探討轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)水生環(huán)境中軟體動(dòng)物抗氧化-代謝酶系統(tǒng)的影響，旨為轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響研究積累數(shù)據(jù)，為轉(zhuǎn)基因水稻的全面生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻品種：供試轉(zhuǎn)Bt基因水稻品種為轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac復(fù)合基因抗蟲水稻恢復(fù)系華恢1號(hào)(HH1)，以其親本非轉(zhuǎn)基因品種明恢63(MH63)為對(duì)照，稻種均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供。

田間種植設(shè)計(jì)：于2012年6月至9月單季種植于湖南湘潭的項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)，手工單本移栽，試驗(yàn)田1 530 m2,間隔為 9個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積170 m2,并隨機(jī)相間分成3組，每組3小區(qū)(3次重復(fù))。其中1組種植華恢1號(hào)(HH1)，全生育期不施任何化學(xué)殺蟲劑；另外2組均種植非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63，其中1組全生育期不施任何化學(xué)殺蟲劑，為陰性對(duì)照(MH63)，另1組稻田則按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)用藥習(xí)慣噴施農(nóng)藥作為陽性對(duì)照(MH63C)。水肥管理相同且均按常規(guī)生產(chǎn)操作。

MH63C組施藥：全生育期施藥3次，7月2日施用阿維菌素、紋曲清與吡蟲啉；7月21日施用阿維菌素2%、水胺硫磷35%、甲硫乙唑醇27%、曹達(dá)5 s與吡蚜酮25%；8月12日施用阿維菌素2%、丙溴辛硫磷25%、速虱靈30%與噻嗪酮25%。施用方法均按說明常規(guī)混合施用。

指示動(dòng)物：以中華圓田螺為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指示動(dòng)物，均采自湘鄉(xiāng)市東郊鄉(xiāng)稻田及相鄰水溝，挑選螺齡相近、體重約2.5 g的健康個(gè)體于室內(nèi)馴養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。在稻田平整后水稻移栽前，每小區(qū)稻田中以對(duì)角線法設(shè)置樣方池3個(gè)(長×寬=50 cm ×100 cm)，樣方間距約8 m，將池內(nèi)泥清空置入尼龍紗網(wǎng)框后，再將泥回填并使紗網(wǎng)高出水面上20 cm防逃。水稻移栽后每樣方池中接入田螺20只，水稻收割前10 d全部撿出回收，用于室內(nèi)生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.2 田螺組織勻漿液制備

將回收的田螺每組隨機(jī)取5只，解剖取其肝臟和鰓，用0.86% 預(yù)冷生理鹽水分別制成10%的肝、鰓組織勻漿液，檢測(cè)各處理組田螺肝、鰓中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)、還原型谷胱甘肽(GSH)與谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)活性。

1.3 檢測(cè)方法

SOD 用鄰苯三酚自氧化法[19]測(cè)定,CAT 活性用紫外分光光度法[20]測(cè)定,ACP用對(duì)硝基酚磷酸法[20]測(cè)定，SOD、CAT與ACP的酶活性單位均為U·mg-1pro。GST 活力用CDNB 比色法[21]測(cè)定，GSH含量、GSH-PX 活性用南京建成生物公司相應(yīng)試劑盒測(cè)定。酶液蛋白質(zhì)含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[22],單位為mg·mL-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，采用單因素方差分析(ANOVA)、S-N-K、LSD 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)與差異顯著性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 中華圓田螺的SOD響應(yīng)

分別生長在Bt稻華恢1號(hào)(HH1)、非Bt稻明恢63(MH63)及施藥的非Bt稻明恢63(MH63C)3類稻田生境中的中華圓田螺肝臟與鰓SOD活性如圖1所示。HH1生境與MH63C生境中中華圓田螺肝臟SOD活性明顯高于MH63生境，且以HH1生境中SOD活性最高。與對(duì)照MH63稻田生境相比，其SOD活性為HH1組極顯著高于MH63組(p<0.01)，MH63C組顯著高于MH63組(p<0.05)；其中HH1組SOD活性較MH63組增加了111.95%、MH63C組較MH63組增加了41.40%，但HH1組僅稍高于MH63C組，差異不顯著(p>0.05)。

與肝臟SOD活性表現(xiàn)不同，鰓SOD活性MH63C組略高于HH1組與MH63組，但MH63組和MH63C組、HH1和MH63C組以及HH1組與MH63組間均無顯著差異(p>0.05)。

2.2 中華圓田螺的CAT響應(yīng)

3種稻田生境中中華圓田螺CAT活性關(guān)系見圖2。其中鰓CAT活性太低，未能檢出。HH1與MH63C生境中中華圓田螺肝臟中SOD活性均極顯著高于MH63生境(p<0.01)，且以HH1生境中CAT活性最高，MH63C組次之，但HH1與MH63C組之間CAT活性差異不顯著。與對(duì)照MH63稻田生境相比，HH1和MH63C生境組肝臟CAT活性分別提高了2.513倍和1.357倍。

圖1 不同稻田生境中中華圓田螺SOD活性比較注：** p<0. 01, 下同。Fig. 1 Comparision the activities of SOD of Cipangopaludina cathayensis in different rice fields Note: ** p<0. 01, Same for below

圖2 不同稻田生境中中華圓田螺CAT活性比較Fig. 2 Comparision the activities of CAT of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

2.3 中華圓田螺的GSH-Px響應(yīng)

田螺肝臟中GSH-Px活性以HH1組最高，MH63組次之，MH63C組最低，但經(jīng)多重比較與差異顯著性分析，彼此之間均未出現(xiàn)顯著差異(p>0.05)；鰓中GSH-Px活性以MH63C組最高，HH1最低，且MH63C組極顯著高于HH1和MH63組(p<0. 01)，而HH1與MH63之間GSH-Px活性差異不顯著(p>0.05)(圖3)。

2.4 中華圓田螺的GSH響應(yīng)

GSH含量比較如圖4所示，HH1和MH63C生境中田螺肝臟GSH含量略高于MH63組，但均無顯著差異(p>0.05)。與對(duì)照組MH63比較，MH63C組田螺鰓GSH含量是MH63組的GSH含量的1.69倍，差異顯著(p<0.05)，而HH1組田螺鰓GSH含量略低于MH63C組，略高于MH63組，但均無顯著差異。

圖3 不同稻田生境中中華圓田螺肝臟GSH-Px活性Fig. 3 The activities of GSH-Px of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

圖4 不同稻田中中華圓田螺GSH含量注：*p<0. 05Fig. 4 The GSH content of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields Note: * p<0. 05

2.5 中華圓田螺的ACP響應(yīng)

HH1生境中田螺肝臟ACP活性均極顯著高于MH63和MH63C組(p<0.01)。HH1生境組肝臟ACP活性較MH63和MH63C生境組分別提高了112.4%和98.8%，而MH63C和MH63組活性則差異不明顯。鰓ACP活性以MH63C組最高，HH1次之，對(duì)照MH63生境組最低，但3種生境中田螺鰓ACP活性差異不顯著(p>0.05)(圖5)。

圖5 不同稻田中中華圓田螺ACP活性Fig. 5 The activities of ACP of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

2.6 中華圓田螺的GST活性響應(yīng)

MH63C生境中田螺肝臟GST活性最高，極顯著高于MH63和HH1生境組(p<0.01)，其中MH63C組較MH63組GST活性提高了66.16%，而HH1和MH63組間活性差異不顯著(p>0.05)。與肝臟GST活性表現(xiàn)相似，鰓GST活性以MH63C組最高，MH63C組鰓GST活性分別是HH1組與對(duì)照MH63組活性的1.7倍與2.02倍，差異極顯著(p<0.01)；HH1組鰓GST活性略高于MH63組，但無顯著差異(p>0.05)(圖6)。

圖6 不同稻田中中華圓田螺GST活性Fig. 6 The activities of GST of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

3 討論(Discussion)

GSH和GST在生物的解毒代謝中發(fā)揮重要作用，GSH為GSH-Px和GST 的特有底物，GST催化GSH與一些化學(xué)物質(zhì)和親電子化合物結(jié)合, 生成無毒性或毒性小的GSH 硫結(jié)合物；同時(shí)能催化有機(jī)過氧化物還原成相應(yīng)的醇,與硒谷胱甘肽過氧化物酶(Se-GPx)協(xié)同作用起抗氧化作用，從而減少這些物質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)生物大分子結(jié)合的可能性，減少有害物質(zhì)對(duì)組織的損傷[24]。熊燕飛等[25]報(bào)道轉(zhuǎn)Bt基因雜交水稻汕優(yōu)63配制的飼料對(duì)昆明種雄性小白鼠體內(nèi)的保護(hù)酶和解毒酶活性影響不明顯,轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)昆明種雄性小白鼠的生理代謝無明顯副作用。本實(shí)驗(yàn)中生長在HH1和MH63稻田生境中的中華圓田螺肝組織勻漿液中GSH含量和GST酶活性差異不顯著，表明中華圓田螺通過提升抗氧化酶活性對(duì)多余的氧自由基進(jìn)行有效清除，因而解毒代謝相關(guān)酶GST活性和GSH含量變化不明顯，說明HH1號(hào)產(chǎn)生的Bt毒蛋白對(duì)田螺沒有明顯的毒副作用。

ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，與機(jī)體物質(zhì)代謝關(guān)系密切，它通過催化磷蛋白中磷酯鍵的水解，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并可被外源物質(zhì)誘導(dǎo)[26]。俞超等[27]報(bào)道轉(zhuǎn)Bt基因水稻在種子萌發(fā)和幼苗抗逆性以及水稻的生長能力等方面都要優(yōu)于原親本，其淀粉酶和過氧化氫酶含量及根系活力均高于對(duì)照秀水11。HH1稻田生境中中華圓田螺肝臟ACP酶活性顯著高于MH63稻田生境對(duì)照組，表明HH1號(hào)稻田生境中中華圓田螺DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝能力明顯增強(qiáng)，與其抗氧化能力顯著提高相類似，可能與肝臟作為主要的解毒器官和脂肪代謝場(chǎng)所，其抗氧化酶和代謝酶類活性通常較高有關(guān)。與肝臟組織勻漿液中所測(cè)的各類酶活性情況不同，HH1號(hào)生境中中華圓田螺鰓組織勻漿液中所測(cè)的各類酶活性與對(duì)照組MH63生境比較，均無顯著差異，說明HH1對(duì)中華圓田螺鰓組織沒有明顯毒副作用。

施用殺蟲劑明顯激活中華圓田螺肝臟和鰓中抗氧化酶系統(tǒng)和解毒代謝酶活性，MH63C組田螺解毒代謝酶活性明顯高于HH1組，說明Bt毒蛋白對(duì)田螺的影響明顯弱于殺蟲劑產(chǎn)生的脅迫作用。采用轉(zhuǎn)Bt基因水稻防治害蟲對(duì)環(huán)境生物的毒性影響更小。與Bt水稻對(duì)稻田節(jié)肢動(dòng)物群落的影響明顯弱于化學(xué)殺蟲劑的研究相似[28]。MH63C和MH63生境中田螺ACP活性并未表現(xiàn)出明顯差異，則與農(nóng)藥作為強(qiáng)毒性化學(xué)物質(zhì)主要產(chǎn)生毒性作用，因而主要影響解毒代謝酶有關(guān)。

轉(zhuǎn)Bt基因作物的大部分 Bt 毒素可通過根系分泌物、花粉飄落及作物殘?bào)w釋放到農(nóng)田土壤中[29]，Bt毒蛋白質(zhì)分子所帶電荷或極性基團(tuán)，會(huì)借助于靜電引力吸附到土壤表面上相應(yīng)的陽離子或陰離子基團(tuán)上，這種結(jié)合態(tài)仍有較強(qiáng)的殺蟲活性并能抵抗土壤微生物的降解[30]，土壤中的水稻植株殘?bào)w內(nèi)的Cry1Ab可持續(xù)作用于土壤微生物、土壤動(dòng)物與土壤酶等[31-34]。同時(shí)，轉(zhuǎn)Bt作物中Bt殺蟲蛋白的表達(dá)及在環(huán)境中的降解存在時(shí)空動(dòng)態(tài)[35]，因而在其周圍環(huán)境傳遞過程中也可能存在時(shí)空動(dòng)態(tài)。在后續(xù)研究中可綜合考慮，以便為更全面充分地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt基因水稻的安全性提供更多信息。

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