張 帆，白 玲，郭瑞子，馬 驛，孫永學(xué),*

1. 國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)(環(huán)境評(píng)估)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642 2. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088

洛克沙胂(roxarsone)是一種有機(jī)胂類化合物，作為畜禽專用抗菌、促生長(zhǎng)的飼料添加劑已在我國(guó)得到廣泛使用，研究表明，畜禽攝入有機(jī)胂添加劑后在胃腸道吸收少、體內(nèi)蓄積時(shí)間很短、殘留量低，80%～90%以原形通過(guò)糞便排泄到體外。一個(gè)養(yǎng)殖規(guī)模為2億羽肉雞場(chǎng)，每年向環(huán)境排放8 t以上的砷[1]。獸藥隨動(dòng)物糞、尿等排泄物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，污染環(huán)境土壤、表層水體等，并通過(guò)食物鏈影響植物、動(dòng)物和微生物的正常生命活動(dòng)，或在植物中富集，最終將影響人類的健康[2-3]。洛克沙胂污染土壤后使其質(zhì)量降低，農(nóng)作物產(chǎn)量減少，最終經(jīng)過(guò)土壤物質(zhì)循環(huán)降解可能轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)砷形式而造成更嚴(yán)重的危害。

土壤中的磷脂大部分以活體生物的組分形式出現(xiàn)，磷脂脂肪酸(PLFA)即為甲基化土壤中提取磷脂成分后得到的脂肪酸產(chǎn)物，它具有屬的特異性，不同的微生物能夠通過(guò)不同生化途徑形成不同的PLFA，根據(jù)不同微生物特定磷脂脂肪酸標(biāo)記物的種類和組成比例可了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化[4]。相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物學(xué)分析方法，磷脂脂肪酸分析技術(shù)是一種不需要通過(guò)分離和培養(yǎng)土壤微生物，并且能更全面揭示土壤中微生物的生物量和生態(tài)結(jié)構(gòu)，是一種更為快速、簡(jiǎn)便、精確的微生物分析方法[5]。PLFA技術(shù)被廣泛運(yùn)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中，可動(dòng)態(tài)檢測(cè)土壤污染暴露與恢復(fù)過(guò)程中微生物的變化，為污染土壤的修復(fù)提供理論科學(xué)依據(jù)[6-7]。本試驗(yàn)通過(guò)在土壤中添加不同濃度洛克沙胂，借助磷脂脂肪酸方法，分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化特征，明確土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性類型的差異程度，了解洛克沙胂對(duì)土壤微生物群落的影響強(qiáng)度，探索洛克沙胂污染與土壤微生物細(xì)胞指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以揭示洛克沙胂在環(huán)境中殘留對(duì)土壤微生物學(xué)性狀的影響，為評(píng)估和監(jiān)控洛克沙胂對(duì)土壤環(huán)境的早期污染和生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材 料

洛克沙胂原料藥，含量98.5%，購(gòu)自廣州惠華動(dòng)物保健品有限公司。土壤采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田20～100 cm 土層的勻質(zhì)土壤，色深，質(zhì)細(xì)，基本理化性狀為：有機(jī)碳48.35±3.52 g·kg-1，總氮2.38±0.19 g·kg-1，總磷12.27±1.99 g·kg-1，總鉀0.15±0.04 g·kg-1，pH 6.2±0.55。供試土壤未檢測(cè)出洛克沙胂殘留。

1.2 方 法

1.2.1 土壤處理

新鮮土樣過(guò)4 mm篩后于室溫下放置3 d，分裝到5 L的塑料桶中，每桶裝3 kg鮮土，按每3 kg鮮土加入50 mL不同濃度的洛克沙胂溶液混勻，使藥物含量分別為(以As計(jì))：Ⅰ組15 mg·kg-1、Ⅱ組75 mg·kg-1、Ⅲ組150 mg·kg-1，每處理設(shè)3次重復(fù)。將土壤含水量調(diào)至飽和持水量的50%，并用濕布蓋于土表，置于室溫(20 ℃～25 ℃)下培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中為了保持土壤濕度不變，損失的水分通過(guò)稱重法補(bǔ)充。各組設(shè)3個(gè)重復(fù)。于處理后第1、2、3、5、8周分別采取培養(yǎng)土壤進(jìn)行分析。

1.2.2 磷脂脂肪酸法測(cè)定土壤微生物群落

1.2.2.1 磷脂脂肪酸分離和提取步驟：取5 g土壤分別加入 4.0 mL 磷酸緩沖液、5.0 mL 氯仿、10 mL甲醇，震蕩 2 h，2 500 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，再向土壤中加入相同體積的磷酸緩沖液、氯仿和甲醇溶液，震蕩1 h，離心，合并2 次上清液，氮?dú)獯蹈?，過(guò)硅膠柱，洗脫液依次采用氯仿5 mL，丙酮10 mL，甲醇5 mL。收集甲醇相，氮?dú)獯蹈伞?再加入 0.2 mol·L-1的氫氧化鉀、甲醇各1 mL，最后用正己烷萃取，收集正己烷相，定容至 100 μL，用于氣相色譜質(zhì)譜儀的測(cè)定。

1.2.2.2 氣相質(zhì)譜條件設(shè)置：2010QP ，GC-MS聯(lián)用儀GC分析條件：色譜柱為DB5MS，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，采用無(wú)分流形式，流速0.8 mL·min-1。升溫程序：100 ℃保溫1 min；100 ℃～190 ℃ 1 min升溫 5 ℃；190 ℃ 保溫1 min；190 ℃～230 ℃ 1 min 升溫 3 ℃；230 ℃ 保溫1 min；230 ℃～290 ℃ 1 min 升溫10 ℃；290 ℃ 保溫2 min。

1.2.2.3 磷脂脂肪酸的鑒定：磷脂脂肪酸(PLFA)的鑒定見(jiàn)有關(guān)方法[8]。脂肪酸的命名以脂肪酸碳總數(shù)開(kāi)始，常用的命名格式為X:YωZ(c/t)，其中，X是總碳數(shù)，后面跟一個(gè)冒號(hào)，Y表示雙鍵數(shù)，ω表示甲基末端，Z是距離甲基端的距離，c表示順式空間構(gòu)造，t表示反式空間構(gòu)造，前綴“i”和“a”代表支鏈的順式異構(gòu)和反式異構(gòu)，“Me”代表甲基，“OH”代表羥基，“cy”代表環(huán)丙基。脂肪酸含量測(cè)定以正十九烷脂肪酸甲酯(19:0)為內(nèi)標(biāo)，色譜峰面積定量。細(xì)菌總生物量以PLFA i15:0，a15:0，15:03OH，il6:0，16:1ω7c，16:1ω9c，a17:0，il7:0, cyl7:0，18:1ω7c，cyl9:0之和估算；革蘭氏陰性菌生物量以16:1ω7c，16:1ω9c，cyl7:0，18:1ω7c，cyl9:0之和估算；革蘭氏陽(yáng)性菌生物量以i15:0，al5:0，15:03OH，il6:0，a17:0，il7:0之和估算；真菌生物量根據(jù) 18:2ω6，18:1ω9c 的總濃度來(lái)估算；放線菌生物量根據(jù)18:10Me的總濃度來(lái)估算[9-11]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2007 處理數(shù)據(jù)，SPSS 11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和主成分分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同處理之間的差異( LSD，α= 0.05)。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果(Results)

2.1 磷脂脂肪酸各指標(biāo)變化

第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量見(jiàn)表1，第1、2、3、5和8周洛克沙胂對(duì)土壤各類磷脂脂肪酸的影響見(jiàn)圖1。由圖1顯示定性與定量的17種磷脂脂肪酸(PLFAs)隨著洛克沙胂濃度增加各自變化的情況，與對(duì)照組相比，洛克沙胂處理的各濃度組檢測(cè)出的大多數(shù)脂肪酸都出現(xiàn)不同程度的減少，且17種脂肪酸的含量變化大多數(shù)與藥物濃度的變化成反比。

圖1 洛克沙胂對(duì)土壤各類磷脂脂肪酸的影響(A，用藥第1周；B，用藥第2周；C，用藥第3周；D，用藥第5周；E，用藥第8周)注：同磷脂脂肪酸生物標(biāo)記數(shù)據(jù)無(wú)相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。Fig. 1 The effects of roxarsone treatments on each PLFA content (A, after treated with roxarsone 1 week; B, after treated with roxarsone 2 weeks; C, after treated with roxarsone 3 weeks; D, after treated with roxarsone 5 weeks; E, after treated with roxarsone 8 weeks)Note: the data in same PLFA biomarker without the same letter means have significant difference (p<0.05).

表1 第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量Table 1 The effects of roxarsone treatments on each PLFA content in the first week

2.2 PLFA總量及不同土壤微生物PLFA表征含量的變化

洛克沙胂處理組在不同采樣時(shí)間的土壤微生物PLFA總量變化見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在整個(gè)采樣周期里，每克土壤總的PLFA含量在洛克沙胂的影響下明顯減少，而且存在劑量依賴效應(yīng)。第1、2、3、5、8周，添加洛克沙胂各組的PLFA總量均與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)；第1、2、3、5周各組的PLFA總量隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，第8周各組的PLFA總量開(kāi)始增加。

洛克沙胂對(duì)不同土壤微生物的影響見(jiàn)表2，G+菌的PLFA表征含量比G-菌的含量高。第1、2、3、5、8周，添加洛克沙胂各組的G+菌的PLFA表征含量均與對(duì)照組差異不顯著；第1、2、3、5周，各組的G-菌的PLFA表征含量均與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)，第8周，各組的G-菌的PLFA表征含量與對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果表明，洛克沙胂的土壤暴露脅迫對(duì)G-菌的抑制作用比對(duì)G+菌和放線菌的抑制作用強(qiáng)，不同時(shí)間各種濃度的藥物處理對(duì)G+菌和放線菌的影響變化不明顯，對(duì)G-菌的影響在試驗(yàn)后期(第8周)開(kāi)始減弱。不同采樣時(shí)間低濃度組(w=15 mg·kg-1)的真菌PLFA表征含量均與對(duì)照組差異不顯著，高濃度洛克沙胂(w=150 mg·kg-1)使真菌PLFA顯著降低，第1、2、3、5、8周，高濃度處理組的真菌PLFA含量分別是對(duì)照組PLFA含量的56.46%、19.80%、57.02%、62.32%和57.30%。

圖2 不同處理的磷脂脂肪酸總量注：同采樣時(shí)間數(shù)據(jù)無(wú)相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。Fig. 2 Contents of total PLFAs contents for each treatmentNote: the data in same time without the same letter means have significant difference (p<0.05).

表2 第1周不同處理組土壤中各類磷脂脂肪酸的含量Table 2 Content of PLFA biomarker of different soil microorganisms for each treatment

注：同采樣時(shí)間數(shù)據(jù)無(wú)相同字母者，表示差異顯著(p<0.05)。

Note: the data in same time without the same letter means have significant difference (p<0.05).

2.3 磷脂脂肪酸的主成分分析

土壤微生物種群結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)，17種脂肪酸的含量變化結(jié)果形成了描述微生物群落結(jié)構(gòu)特征的多元向量，不易直觀比較，對(duì)17種脂肪酸進(jìn)行主成分分析結(jié)果表明：土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)多樣性類型差異明顯。

PC1解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)變化中的變異程度(圖3), 第1周PC1為46.9%，得分系數(shù)(F3,8=73.9,p<0.001)，呈差異極顯著；第2周PC1為55.8%，得分系數(shù)(F3,8=73.9,p<0.05)，差異顯著；第3周PC1為58.3%，得分系數(shù)(F3,8= 57.92,p<0.001)，差異極顯著；第5周PC1為57.5%，得分系數(shù)(F3,8= 91.6,p<0.001)，差異極顯著；第8周PC1為62.5%，得分系數(shù)(F3,8= 76.46,p<0.001)，差異極顯著。由PLFA的結(jié)構(gòu)主成分分析可見(jiàn)，除了第1周時(shí)低濃度組(w=15 mg·kg-1)和對(duì)照組的PCA分析結(jié)構(gòu)差異不明顯以外，第2、3、5、8周時(shí)，各處理組的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)類型差異明顯(p<0.05)，各采樣點(diǎn)的高濃度處理組(w=150 mg·kg-1)與對(duì)照的差異最大(群落結(jié)構(gòu)相差最遠(yuǎn))。結(jié)果表明，培養(yǎng)前中期各濃度處理組之間都有明顯的類型差異，后期(第5、8周)差異不顯著。

圖3 不同處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析(A，用藥第1周；B，用藥第2周；C，用藥第3周；D，用藥第5周；E，用藥第8周)Fig. 3 Principal component analysis of soil microbial community structure from different treatments (A, after treated with roxarsone 1 week; B, after treated with roxarsone 2 weeks; C, after treated with roxarsone 3 weeks; D, after treated with roxarsone 5 weeks; E, after treated with roxarsone 8 weeks)

3 討論(Discussion)

磷脂脂肪酸分析技術(shù)是一種不需要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)就能獲得土壤中微生物信息的方法，是通過(guò)提取微生物細(xì)胞膜中的磷脂成分，定量后得到總磷脂含量(單位：nmol·g-1)，是新興起來(lái)的一種表征微生物生物量的方法。磷脂脂肪酸是除古細(xì)菌外，幾乎所有微生物細(xì)胞膜磷脂的組成成分，具有屬的特異性，不同屬的微生物通過(guò)不同生化途徑而形成不同的PLFAs[12-13]，因此土壤中PLFAs組成和含量的變化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)其進(jìn)行提取，并依據(jù)其中的特征脂肪酸指示的微生物種類，如細(xì)菌、真菌、放線菌及革蘭氏陽(yáng)(陰)細(xì)菌等，可對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其數(shù)量進(jìn)行表征，可鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化。PLFA法分析得到的信息不僅可以表征微生物在量上的變化，還可以依據(jù)其中特征脂肪酸所指示的特定微生物類型的變化，揭示微生物群落結(jié)構(gòu)伴隨外界環(huán)境變化的響應(yīng)動(dòng)態(tài)[14-15]，如：農(nóng)田耕作措施或施肥作用影響下微生物群落結(jié)構(gòu)變化[16]，重金屬污染對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響和不同植被影響下微生物群落結(jié)構(gòu)的改變等[17]，可應(yīng)用于動(dòng)態(tài)檢測(cè)土壤污染與恢復(fù)過(guò)程中微生物的變化，為污染土壤的修復(fù)提供理論科學(xué)依據(jù)[18-19]。

關(guān)于土壤重金屬污染對(duì)微生物生態(tài)影響的研究較多，F(xiàn)rosteg?rd等[14]研究表明重金屬污染導(dǎo)致了土壤中 il5:0，il7:0，16:lω5，16:lω7等磷脂脂肪酸的減少，而 i16:0，brl7:0，brl8:0和cyl7:0等磷脂脂肪酸有所增加；閻姝等[20]研究顯示重金屬污染下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)菌和真菌 PLFA 的變化幅度達(dá)到 30%以上，革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌的脂肪酸比值升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上所顯示的金屬污染土壤的PLFA結(jié)果存在異同。洛克沙胂的土壤暴露脅迫對(duì)G-菌的抑制作用比對(duì)G+菌和放線菌的抑制作用強(qiáng)，不同時(shí)間各種濃度的藥物處理對(duì)G+菌和放線菌的影響變化不明顯；不同采樣時(shí)間低濃度(w=15 mg·kg-1)處理組的真菌PLFA表征含量均與對(duì)照組差異不顯著，高濃度洛克沙胂(w=150 mg·kg-1)使真菌PLFA顯著降低。洛克沙胂本身具有殺菌和球蟲(chóng)的作用，進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后最終會(huì)降解成可溶于水的無(wú)機(jī)砷類物質(zhì)，無(wú)機(jī)砷是毒性較大的類金屬。重金屬作為一種重要的常見(jiàn)污染物，對(duì)微生物的毒害作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是它們極易同一些生物大分子如酶的活性中心，以及極性電子基團(tuán)如蛋白質(zhì)上的巰基、核苷酸上的堿基、磷酸基等結(jié)合，導(dǎo)致這些生物大分子失活；其次，金屬大都不能被生物分解，進(jìn)入生物體內(nèi)后與金屬硫蛋白，類金屬硫蛋白和小分子量的配體如甘氨酸，?；撬岬冉Y(jié)合，極易在生物體內(nèi)蓄積，最終引起微生物死亡。土壤微生物數(shù)量減少，PLFA量即降低。

洛克沙胂PLFA主成分分析，明顯區(qū)分了不同濃度洛克沙胂影響下的群落結(jié)構(gòu)類型分異程度，具體表現(xiàn)在隨著污染程度的增加，其在主成分分布圖上向X軸的負(fù)方向延伸，洛克沙胂濃度越高則與對(duì)照組相距越遠(yuǎn)；第1周時(shí)低濃度組與對(duì)照組差異不顯著，自第2周以后低濃度組與對(duì)照組可以明顯分開(kāi)，說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)洛克沙胂的毒性增強(qiáng)；在不同采樣時(shí)間，中、高濃度組與對(duì)照組各自明顯分開(kāi)，差異顯著說(shuō)明中高濃度洛克沙胂改變了土壤微生物結(jié)構(gòu)；第5、8周時(shí)，不同濃度洛克沙胂組相互間的結(jié)構(gòu)差異程度減輕。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洛克沙胂顯著降低了土壤微生物各類磷脂脂肪酸和PLFA總量，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分異明顯，且存在一定的劑量依賴效應(yīng)，洛克沙胂濃度越高，∑PLFA越低，其中150 mg·kg-1的洛克沙胂處理影響最大。由此可見(jiàn)，洛克沙胂可致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性改變，暴露濃度越高其作用越強(qiáng)。原因是洛克沙胂殺菌而導(dǎo)致土壤微生物量降低，濃度越大殺菌能力越強(qiáng)。同時(shí)，洛克沙胂對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響還表現(xiàn)出時(shí)間差異，在暴露脅迫的早、中期(第1、2、3周)，對(duì)照組和各藥物處理組之間存在明顯的差異變化，在暴露脅迫的后期(第5、8周)，各藥物處理組間的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分異逐漸縮小，這可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，土壤中洛克沙胂逐漸降解或化學(xué)結(jié)構(gòu)改變，濃度降低，影響減弱，從而逐漸恢復(fù)土壤微生物生態(tài)平衡，也可能是土壤中一些對(duì)洛克沙胂有一定耐受性的細(xì)菌增殖，使微生物總量增加。

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