劉金，黃毅，孫艷波，顏亨梅,*

1. 北京師范大學珠海分校不動產學院，珠海 519087 2. 湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081

水稻是我國乃至全世界的主要糧食作物，水稻生產在保障基本營養(yǎng)供給和糧食安全方面，意義非常重大，其安全性尤為重要。與傳統(tǒng)育種方法不同的是，轉基因生物技術是應用生物技術手段打破了物種生殖隔離屏障，將一種(類)生物的某一目的基因片段引入到另一種(類)生物基因組中改變其遺傳性狀以獲得人們期望的優(yōu)良性狀，使動物、植物、微生物之間可以實現(xiàn)遺傳物質交流。為了防止在基因操作過程中，把一些可能對人體健康或對環(huán)境安全有害的個別基因轉入受體生物，或者由于基因操作引起受體生物產生某些不可預期的變化，影響動物、人體健康和環(huán)境安全，世界各國政府都對轉基因生物的安全性高度重視，并積極加以評估。

轉基因稻谷對人類健康是否產生危害，對機體細胞、組織和器官等是否具有毒性及損害，一直以來爭議不斷，日趨激烈，近幾年來在全世界引起了普遍的關注[1-4]。隨著轉基因作物種植面積不斷擴大和我國對轉基因糧食的需求量不斷增加，對其進行安全性評價具有重大的意義[5-7]。

目前國內外對轉基因稻谷所做安全性評價研究不少，但主要集中在傳統(tǒng)毒理學方法(動物試驗)方面，一般采用代謝產物分析[8]、毒代動力學[9-10]、慢性毒性及亞慢性毒性[11-12]、繁殖試驗和致畸試驗等[13-14]方法，其安全性評價方法主要通過飼喂模型動物來檢測轉基因稻谷對動物靶器官潛在的影響[2,14-15]。整個試驗過程耗時長，工作量大，費用高；傳統(tǒng)毒理學方法檢測層面仍停留在組織、器官病理性改變層面，并未涉及細胞層面。本研究采用CCK-8試驗(Cell Counting Kit-8 Assay)和中性紅試驗(Neutral Red Uptake assay, NRU)來檢測轉基因稻米全蛋白成分對小鼠淋巴細胞的損傷程度(毒性大小)，耗時短，工作量較小，費用較低，能夠在細胞水平上檢測毒性大小，對轉基因大米的細胞毒性進行客觀、科學的評價。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

轉基因大米(Bar68-1)及對照組非轉基因親本大米D68(由中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所鑒定提供)。試驗以小鼠淋巴細胞系為靶細胞，該細胞系取自昆明小鼠(Musmusculus)脾臟，由湖南師大生科院心臟發(fā)育實驗室提供。

1.2 試 劑

苯甲基磺酰氟(PMSF)(美國Amresco公司)，Western及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)，長春新堿(美國Amresco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，中性紅染料(上海三愛思試劑有限公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(將NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、Na2HPO41.56 g、KH2PO40.20 g定容至1 L，室溫儲存，高壓消毒后使用)，中性紅儲備液(將中性紅10.0 g加入去離子水至100 mL，在37 ℃溫度下放置30 min后搖勻，室溫保存，臨用時用去離子水稀釋40倍后即可)，中性紅萃取液(水4.9 mL+乙醇5.0 mL+冰乙酸100 μL充分混勻后配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.3 儀器設備

全波長多功能酶標儀(TECAN Safire2，法國)，恒溫振蕩器(上海精宏公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(GH5000B，美國Forma公司)，生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 大米全蛋白的制備

分別取新鮮Bar68-1大米和D68大米約10 g，加入液氮后用研缽充分研磨成粉末。融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前的幾分鐘加入苯甲基磺酰氟(美國Amresco公司)，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L-1。稱取50 mg樣品，按照每20 mg組織加入100～200 μL裂解液的比例加入Western及IP細胞裂解液(碧云天)。充分裂解后，以10 000～14 000 g離心3～5 min，取上清液。將上清液放入密理博Microcon Ultra-0.5 3 000超濾管，再放入1.5 mL離心管以14 000 g離心，棄離心管里濾液，往超濾管中加入450 μL、4 ℃預冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)。以14 000 g離心，棄離心管里濾液，此步驟重復1次。以1.5 mL新離心管替換，倒置超濾管，以1 000 g的速度離心，收集蛋白。將提取的轉基因大米全蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，利用超聲波震蕩以充分混勻。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)測定大米全蛋白的濃度，并調節(jié)濃度為1 mg·mL-1，將原液置于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.4.2 實驗分組

將1 mL小鼠淋巴細胞懸浮液(密度為50 000個·mL-1)加入24孔培養(yǎng)板中，在37 ℃下培養(yǎng)細胞。Bar68-1大米和D68大米全蛋白的暴露濃度分別設定為25、50、100和200 μg·mL-1，各濃度暴露時間分別為2 h、6 h、24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)作為空白劑陰性對照，長春新堿(美國Amresco公司)作為CCK-8試驗、中性紅攝取試驗的陽性對照。所有試驗重復3次。

1.4.3 細胞活性檢測

1.4.3.1 CCK-8試驗

參考Jiang等[16]的方法，按照CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)上面的步驟進行試驗。使用分光光度計(TECAN，法國)450 nm波長測量并記錄結果，以測定細胞中脫氫酶(催化物質氧化還原反應的酶)活性表示細胞活性。

1.4.3.2 中性紅攝取(NRU)試驗

根據Putnam等[17]和Canal-Raffin等[18]的操作步驟并加以改進，在暗室黃光下完成試驗。最后參考Geh等[19]方法，用分光光度計(TECAN，法國)于540 nm波長處檢測樣品并記錄結果，以測定溶酶體攝入中性紅的量來表示細胞活性。

1.5 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據用SPSS17.0統(tǒng)計包處理。數(shù)據用獨立樣本T檢驗或單因素方差分析(ANOVA)，如果方差齊，使用最小顯著法(LSD)兩兩之間比較；如果方差不齊，就應用Dunnett’s T3進行兩兩比較。當p<0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 CCK-8試驗

在3個孵育時間段后，長春新堿組的小鼠淋巴細胞經CCK-8試驗檢測，所測得的淋巴細胞存活率顯著低于空白對照組的淋巴細胞(p<0.05，見表1)。淋巴細胞經長春新堿(0.025 μg·mL-1)分別孵育2 h、6 h和24 h后，測得細胞存活率分別為79.45±1.21、73.92±0.94和59.53±1.13，損傷作用與時間存在一定的效應關系。如轉基因大米Bar68-1組與非轉基因大米D68組體外CCK-8試驗結果所示(見圖1)，淋巴細胞與轉基因大米Bar68-1全蛋白共同孵育后的存活率和與非轉基因大米D68共同孵育后的存活率相比較，無顯著差異(p>0.05)；與空白對照組存活率比較，差異不顯著(p>0.05)。

2.2 中性紅攝取試驗

在3個孵育時間段后，長春新堿組的小鼠淋巴細胞經中性紅攝取試驗檢測，所測得的淋巴細胞存活率顯著低于空白對照組的淋巴細胞(p<0.05，見表2)。淋巴細胞經長春新堿(0.025 μg·mL-1)分別孵育2 h、6 h和24 h后，測得細胞存活率分別為81.26±1.35、74.85±1.16和60.51±1.27，損傷作用與時間存在著明顯的效應關系。轉基因大米Bar68-1全蛋白組與非轉基因大米D68全蛋白組體外中性紅試驗結果顯示(見圖2)，轉基因大米Bar68-1全蛋白孵育的淋巴細胞存活率和與非轉基因大米D68孵育的相比，不存在顯著性差異(p>0.05)；與空白對照組存活率比較，差異不顯著(p>0.05)。

圖1 CCK-8試驗細胞存活率比較注：圖中C0表示空白對照組，Z25、Z50、Z100和Z200分別表示25、50、100和200 μg·mL-1轉基因大米全蛋白組，C25、C50、C100和C200分別表示25、50、100和200 μg·mL-1非轉基因大米全蛋白組,(下同)。Fig. 1 Comparison of survival rate of lymphocytes detected by CCK-8 assayNote: C0: Blank control; Z25、Z50、Z100和Z200 represented 25, 50, 100 and 200 μg·mL-1 of whole proteins of GM rice, respectively; C25、C50、C100和C200 represented 25, 50, 100 and 200 μg·mL-1 of whole proteins of non-GM rice, respectively.

表1 體外CCK-8試驗淋巴細胞存活率(平均值±SD)Table 1 The survival rate of lymphocytes detected by CCK-8 assay in vitro (Mean±SD) (%)

注：﹡表示與空白對照組比較，p<0.05。

Note:﹡Compared with blank control group,p<0.05.

表2 體外中性紅攝取試驗淋巴細胞存活率(平均值±SD)Table 2 The survival rate of lymphocytes detected by neutral red uptake (NRU) assay in vitro (Mean±SD) (%)

注：﹡表示與空白對照組比較，p<0.05。

Note:﹡Compared with blank control group,p<0.05.

圖2 中性紅試驗細胞存活率比較Fig. 2 Comparison of survival rate of lymphocytes detected by red uptake (NRU) assay

3 討論(Discussion)

CCK-8試驗、中性紅攝取試驗同屬細胞毒性檢測試驗，但兩者的檢測機理不同：CCK-8試驗主要通過評價細胞內脫氫酶的活力來檢測細胞的存活率，中性紅試驗通過測量溶酶體攝入染料的量來反映細胞的存活率。兩者有機結合，可有效提高檢測靈敏度和準確度。本研究在細胞毒性檢測方面選取兩種不同檢測機理的試驗，其目的在于提高試驗的客觀準確性。按照毒理學試驗的要求，本試驗暴露時間設定為2 h、6 h和24 h，便于從短期內觀測細胞存活率是否存在著明顯的損傷作用-時間效應關系，以探討細胞毒性大小與暴露時間之間的關系。

CCK-8試驗和中性紅試驗中陽性對照組小鼠淋巴細胞在3個不同孵育時間段后存活率與空白組相比，存在顯著差異(p<0.05)。其中，CCK-8試驗、中性紅試驗測得細胞存活率存在著明顯的損傷作用-時間效應關系。說明CCK-8試驗與中性紅試驗能有效檢出長春新堿(Vincristine, VCR)導致的細胞死亡效應，方法敏感有效。轉基因大米Bar68-1全蛋白組與非轉基因大米D68全蛋白組體外試驗結果顯示，與轉基因大米Bar68-1全蛋白一起孵育后的淋巴細胞存活率與被非轉基因大米D68全蛋白孵育后的細胞存活率相比較，無顯著性差異(p>0.05)；與空白對照組細胞存活率的差異也不顯著(p>0.05)。結果表明，轉基因大米Bar68-1全蛋白對小鼠淋巴細胞無明顯急性細胞毒性，與非轉基因大米D68全蛋白等同。這與陳吳建等[20]對轉基因大米Bt63的安全性評價結果一致，轉基因大米Bt63對人淋巴細胞無明顯細胞毒性。

本研究應用了急性毒性試驗方法，以多個劑量全蛋白分別孵育小鼠淋巴細胞2 h、6 h和24 h，在短期(24 h)內了解轉基因大米Bar68-1全蛋白的毒性大小和特點，所以，試驗結果只能證明轉Bar基因稻谷全蛋白沒有短期試驗中的細胞毒性。至于轉基因大米Bar68-1全蛋白對小鼠淋巴細胞是否具有亞慢性或慢性細胞毒性，還有待于進一步研究。

轉Bar基因抗除草劑稻谷的外源基因——Bar基因的表達產物為膦絲菌素乙酰轉移酶(phosphinthricin acetyl transferase, PAT)，PAT作為Bar基因的表達產物和稻谷的外源成分，在轉Bar基因抗除草劑稻谷中具有一定的含量。研究結果表明，轉基因大米Bar68-1全蛋白對小鼠淋巴細胞無急性細胞毒性，作者認為，可能存在兩種原因：(1)PAT本身對有機體無急性毒性，安全可靠；(2)轉Bar基因稻谷中的PAT含量太低，不足以產生明顯的急性毒性效應。具體情況還有待于進一步研究。

致謝：感謝中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所唐香山博士和湖南師范大學生命科學學院研究生廖四芳等同學的幫助。

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