李健君， 李梅瑜， 高恩軍， 沈光海

(1.延邊大學(xué) 藥學(xué)院, 吉林 延吉 133000; 2.沈陽(yáng)化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142;3.沈陽(yáng)市無(wú)機(jī)分子基材料化學(xué)(國(guó)際)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

鈷是一種重要的生命元素，具有很多重要的生理活性.近年來(lái)，鈷配合物的生物活性引起廣大生物化學(xué)家、配位化學(xué)家、藥物化學(xué)家的關(guān)注，并在這一領(lǐng)域進(jìn)行了很多研究工作[1-4].DNA快速且沒(méi)有節(jié)制地復(fù)制是造成細(xì)胞癌變的起因，作為抑制腫瘤藥物的各種分子，無(wú)論它在體內(nèi)的代謝路徑和作用機(jī)理是怎樣的，最終都是以DNA分子作為重要靶向，所以研究藥物分子與DNA之間的相互作用、探討其作用機(jī)理是研究開(kāi)發(fā)各種新型抗癌藥物的重中之重[5-7].而金屬配位化合物，尤其是過(guò)渡金屬配位化合物多以DNA為靶向，因此研究過(guò)渡金屬配位化合物與DNA的作用機(jī)理是目前人們關(guān)注的熱點(diǎn).本文采用水熱法以1-氫-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸(Htda)為配體，合成[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O]雙核鈷配合物，并使用X-射線單晶衍射法結(jié)合繪圖軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究.使用熒光光譜法，初步研究鈷配合物與DNA的作用機(jī)理.運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳研究配合物對(duì)pBR322 DNA切割作用，證實(shí)配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O]具有潛在藥用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

六水合硝酸鈷：分析純，國(guó)藥試劑；1-氫-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸(Htda)：分析純，濟(jì)南恒化；CT-DNA：國(guó)藥試劑；pBR322 DNA、上樣緩沖液、TAE緩沖溶液和Marker：生化試劑，大連TAKARA.

電子分析天平：Sartorius BS224S；精密數(shù)顯酸度計(jì)：上海雷磁PHS-25； pH復(fù)合電極：E-201-C；磁力攪拌器：金壇大地CJJ-6；電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉101-2； X-射線單晶衍射儀：Bruker Smart CCD；晶體結(jié)構(gòu)分析：SHELX-97軟件包；熒光分光光度計(jì)：Perkin Elmer LS55；電泳儀：上海培青JS-250；自動(dòng)凝膠圖像分析儀：JS-380A.

1.2 配合物的合成

使用電子分析天平稱取0.029 g(0.1 mmoL)六水合硝酸鈷、0.016 g(0.1 mmoL) 1-氫-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸(Htda)混合放于反應(yīng)釜中，加10 mL水溶解，攪拌下，用0.1 mol/L的KOH溶液調(diào)pH值至6.6.置于120 ℃烘箱中恒溫反應(yīng)3 d后，每1 h降溫10 ℃反應(yīng)至室溫.取出，發(fā)現(xiàn)粉紅色透明晶體,產(chǎn)率為55 %.使用X-射線單晶衍射儀測(cè)定所得配合物的晶體結(jié)構(gòu)為[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O].運(yùn)用晶體結(jié)構(gòu)分析軟件確定為目標(biāo)產(chǎn)物.

2 配合物的晶體結(jié)構(gòu)

配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O]的簡(jiǎn)要分子結(jié)構(gòu)如圖1所示(省略氫原子和結(jié)晶水分子).中心原子Co和配體的配位形式是六配位、扭曲八面體構(gòu)型.中心原子Co1分別與O5、O12、O13、O14、N2和N4以配位鍵連接.其中Co1與O5、N4的連接形式為螯合.中心原子Co2分別與O4、O9、O10、O11、N3和N5以配位鍵連接，其中Co2與O4、N3的連接形式為螯合.配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O]的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示(圖中虛線表示氫鍵).由圖2可以看出，配合物的三維結(jié)構(gòu)由配體、配位水、結(jié)晶水之間的氫鍵構(gòu)成.

圖1 配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O] 的分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

圖2 配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O] 三維結(jié)構(gòu)示意圖

3 配合物與DNA的作用

3.1 熒光光譜分析

應(yīng)用熒光光譜法研究配合物與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的作用形式.溴化乙錠(EB)是一種分子熒光探針，被廣泛應(yīng)用于配合物與DNA作用的研究領(lǐng)域[8].EB作為一種共軛的芳香平面分子，本身的熒光強(qiáng)度很低，但當(dāng)EB插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)之間，并形成EB和DNA的復(fù)合物(EB-DNA復(fù)合物)以后，EB-DNA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度較EB本身的熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)幾十倍甚至幾百倍.配合物加入到體系中后，會(huì)與EB競(jìng)爭(zhēng)插入DNA，EB就會(huì)被配合物從DNA堿基對(duì)之間擠出來(lái)，此時(shí)體系的熒光強(qiáng)度就會(huì)比配合物加入之前弱.根據(jù)已報(bào)道過(guò)的熒光篩選法標(biāo)準(zhǔn)：如果配合物使EB-DNA體系熒光強(qiáng)度減弱程度超過(guò)50 %，且配合物與DNA的摩爾比不超過(guò)100，即可認(rèn)為配合物對(duì)DNA發(fā)生了顯著作用[9-10].由斯特恩·沃爾默(Stern Volmer)方程[9]：I0/I=1+Ksq·r(I0/I：存在和不存在配合物時(shí)復(fù)合物熒光強(qiáng)度之比；r：配合物與所加入的DNA的濃度比；Ksq：配合物的熒光猝滅常數(shù))，可說(shuō)明配合物對(duì)DNA插入作用的強(qiáng)弱.Ksq值越大，配合物對(duì)DNA插入作用則越強(qiáng).配合物對(duì)CT-DNA作用的熒光光譜法譜圖見(jiàn)圖3，配合物對(duì)CT-DNA插入作用熒光猝滅常數(shù)見(jiàn)圖4.從圖3可以看出：隨著配合物濃度的增加，EB-DNA復(fù)合物體系的熒光強(qiáng)度會(huì)相應(yīng)減弱.配合物對(duì)CT-DNA作用的熒光光譜法結(jié)果中可以看到猝滅現(xiàn)象，從圖4中可以看出配合物的猝滅常數(shù)Ksq=0.043 6，對(duì)CT-DNA具有一定的插入能力.

1c=0 2c=2.5×10-6mol/L 3c=5.0×10-6mol/L 4c=7.5×10-6mol/L 5c=1.0×10-5mol/Lc(DNA)=1×10-5mol/Lc(EB)=2×10-6mol/L

圖3 不同濃度的配合物與DNA作用的熒光光譜

Fig.3 Fluorescence spectra of complexc

圖4 配合物對(duì)EB-DNA復(fù)合物體系的熒光猝滅常數(shù)

3.2 凝膠電泳分析

電泳，即在外電場(chǎng)作用下，帶電小顆粒會(huì)向與其電荷相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象.在一定pH值條件下，DNA也會(huì)帶有負(fù)電荷，電泳測(cè)定時(shí)會(huì)向電泳槽的正極移動(dòng).電泳現(xiàn)象是分離、鑒定和純化DNA片段的主要方法[11-12].

在DNA電泳實(shí)驗(yàn)中，主要作用力有2種：即對(duì)DNA產(chǎn)生引力的電場(chǎng)力和DNA與電泳基質(zhì)(本文使用瓊脂糖凝膠)間的摩擦力.而DNA通過(guò)電泳基質(zhì)速率的主要影響因素有：DNA分子大小及其構(gòu)型，電泳基質(zhì)濃度，電泳槽兩端的電壓等.本文以瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描來(lái)定性的研究配合物對(duì)pBR322 DNA的切割作用.

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法如下：購(gòu)買(mǎi)的pBR322 DNA保存在零下20°C環(huán)境中.將pBR322 DNA和一定濃度的配合物混合后，在室溫有氧條件下避光靜置2 h，加入上樣緩沖液.使用微量進(jìn)樣器，把經(jīng)過(guò)上述步驟處理后的樣品和空白對(duì)照，緩慢注入到事前準(zhǔn)備好的瓊脂糖凝膠(瓊脂糖含量8 g/L)的孔洞中，加入TAE緩沖溶液，放入JS-250電泳儀中，使用120 V的直流電，電泳時(shí)間1 h，取出，放入JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀中，拍照保存.結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6.

圖5 配合物對(duì)質(zhì)粒pBR322 DNA切割的 電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 配合物對(duì)pBR322 DNA的切割 電泳光密度掃描圖

圖5是配合物對(duì)pBR322 DNA切割的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.Lane 0是純的DNA，Lane 1～3為配合物與DNA在空氣中反應(yīng)2 h之后的樣品(Lane 1～3中配合物濃度分別為13.2、6.6、3.3 μmol/L).從圖5可以看出，隨著配合物濃度的增大，配合物使pBR322 DNA的共價(jià)閉環(huán)帶(Form Ⅰ)逐漸減少，明顯的開(kāi)環(huán)雙鏈環(huán)狀帶(Form Ⅱ)出現(xiàn).通過(guò)對(duì)配合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)可知：配合物對(duì)pBR322 DNA細(xì)胞具有一定的切割能力，并且隨著配合物濃度的增加，切割活性也相應(yīng)增強(qiáng).圖6是由圖5經(jīng)過(guò)光密度掃描所得，由圖6可以更明顯地看出配合物濃度不同，對(duì)pBR322 DNA的切割程度不同，配合物濃度逐漸增加時(shí)，條帶的峰值依次降低，表明配合物濃度越大時(shí)DNA堿基對(duì)所剩越少，因此配合物濃度越大對(duì)pBR322 DNA的切割越好.

4 結(jié)束語(yǔ)

采用水熱合成法制備了1個(gè)鈷(Ⅱ)配合物，分子式為[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O].用X-射線單晶衍射技術(shù)測(cè)定上述配合物的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)其分子間弱作用力進(jìn)行了討論.配合物對(duì)CT-DNA作用的熒光光譜法結(jié)果表明：不同濃度的配合物加入到EB-DNA復(fù)合物之中后均可見(jiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說(shuō)明配合物在各個(gè)濃度下均能以插入的方式與DNA結(jié)合.配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其光密度掃描結(jié)果表明：配合物在各個(gè)濃度下對(duì)pBR322 DNA均有一定的切割能力，且配合物濃度越大對(duì)pBR322 DNA的切割越好.以上熒光光譜實(shí)驗(yàn)和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物[Co2(Htda)2(H2O)6·5H2O]在分子水平對(duì)DNA具有一定的生物活性，具有潛在的藥用價(jià)值，其細(xì)胞水平的生物活性尚有待研究.

參考文獻(xiàn)：

[1] Zheng F K,Wu A Q,Li Y,et al.Copper(Ⅱ),Niclel(Ⅱ) and Cobalt(Ⅱ) Complexes of 4-cyanobenzonic Acid:Syntheses,Crystal Structures and Spectral Properties[J].J.Mol.Struct.,2005,740(1/3):147-157.

[2] Li Q Y,Tang X Y,Zhang W H,et al.Constructions of a Set of Novel Hydrogen-bonded Supramolecules from Reactions of Cobalt(Ⅱ) Salt with Bis(3,5-dimethylpyrazolyl)methane and Different Carboxylic Acids[J].J.Mol.Struct.,2008,879(1/3):119-129.

[4] 宋玉民,康敬萬(wàn),高錦章,等,鈷(Ⅲ)配合物與DNA作用研究[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),2000,16(1):54-57.

[5] 唐宏武,沈昊宇.吖啶橙-細(xì)胞DNA熒光抑制法初步篩選抗癌藥物的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,1997,43(6):711-716.

[6] Gao Enjun,Zhu Mingchang,Yin Hongxi,et al.Synthesis,Characterization,Interaction with DNA and Cytotoxicity in Vitro of Dinuclear Pd(Ⅱ) and Pt(Ⅱ) Complexes Dibridged by 2,2′-Azanediyldibenzoic Acid[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2008,102(10):1958-1964.

[7] 王蕾,吳瓊,朱明昌,等.配合物[M2(PDB)3·4H2O]n的合成、表征及其與DNA作用研究[J].沈陽(yáng)化工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,23(3):198-202.

[8] 郭茂林,楊頻,楊斌盛,等.以溴化乙錠為熒光探針研究二氯二茂鐵與DNA作用方式[J].科學(xué)通報(bào),1995,40(13):1187-1190.

[9] 李志良,畢瓊斯,李俊忠,等.熒光法用于新型抗癌配合物[Pd(tcd)(NO3)2]初步篩選及作用機(jī)制研究[J].化學(xué)通報(bào),1997,60(6):52-55.

[10] 林輝祥,畢瓊斯,彭華,等.鈀鉑抗癌配合物初步篩選的熒光法研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),1992,13(4):443-446.

[11] José R,Julia L,Laura S C,et al.Palladium(Ⅱ) and Platinum(Ⅱ) Organometallic Complexes with the Model Nucleobase Anions of Thymine,Uracil,and Cytosine:Antitumor Activity and Interactions with DNA of the Platinum Compounds[J].Journal of Inorganic Chemistry,2006,45(16):6347-6360.

[12] Gao E J,Gao X N,Guan F,et al.Synthesis and Crystal Structure of Two New Dinuclear Cobalt(Ⅱ) Complexes Interaction with HeLa Cells[J].Eur.J.Med.Chem.,2011,46(1):160-167.