楊苗,張偉剛,楊萍果

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院,山西 太谷 030801；2.南開大學(xué) 現(xiàn)代光學(xué)研究所光電信息技術(shù)科學(xué)教育部重點實驗室，天津 300071； 3.山西師范大學(xué) 生命科學(xué)院，山西 臨汾 041000)

維生素B2(Vitamin B2)，是人體內(nèi)許多重要酶的組成成分，但在人體內(nèi)含量很少，而人體自身又無法合成該化合物，必須從食物中攝取。VB2能促進(jìn)發(fā)育和細(xì)胞再生，保證皮膚、指甲、毛發(fā)的正常生長，幫助消除口腔、唇、舌的炎癥，增進(jìn)視力，減輕眼睛的疲勞，幫助碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝等。因此，它在人體的生長、發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。人體中缺乏維生素B2會引起多種疾病。

牛奶是人們?nèi)粘Ｉ钪凶钕矏鄣氖澄镏?，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、維生素等多種營養(yǎng)成分。早在上世紀(jì)30年代化學(xué)家哥爾倍格從牛奶中提取VB2，在2年后由化學(xué)家哥恩合成。目前維生素B2含量的研究方法主要有高效液相色譜法[1,2]、熒光分析法[3,4]、電化學(xué)法[5]等。不同的檢測方法各有優(yōu)缺點，如高效液相色譜法對高沸點、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析有優(yōu)勢，但該方法的缺點是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間(進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等)中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。電化學(xué)法的缺點是電極選擇性不高，易發(fā)生副反應(yīng)，降低電流效率，電極易形成吸附層和氧化膜，污損電極使電壓升高。

熒光分析法具有靈敏度高、干擾少、線性范圍寬、選擇性好、樣品用量少、操作簡便等優(yōu)點,被廣泛用于食品[1,2，6～9]、藥品[3，5，7]及環(huán)境[4]等領(lǐng)域的檢測，是一種有效的光譜分析技術(shù)。劉杰等[10]采用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)技術(shù)研究鮮牛奶變質(zhì)過程，發(fā)現(xiàn)牛奶的熒光光譜與其變質(zhì)過程有密切的關(guān)系；顧春峰[8]等連續(xù)幾天對不同牧場合格奶樣的三維熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)熒光光譜可區(qū)分不同牧場來源的奶樣，判斷該牧場的奶樣是否穩(wěn)定，但采用熒光光譜技術(shù)對牛奶中維生素B2的成分檢測報道很少。本文采用熒光光譜技術(shù)分析法研究不同環(huán)境(酸、堿、光照、溫度)對純牛奶中維生素B2含量的影響，為從牛奶中攝取VB2提供理論參考。

1 熒光產(chǎn)生的原理

大多數(shù)分子在室溫時均處在電子基態(tài)的最低振動能級，當(dāng)物質(zhì)分子吸收了與它所具有的特征頻率相一致的光子時，由原來的能級躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)中各個不同振動能級(圖1)。其后，大多數(shù)分子常迅速降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，在這一過程中它們和周圍的同類分子或其他分子撞擊而消耗了能量，因而不發(fā)射光。分子在第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級停留約10～9 s之后,直接下降至電子基態(tài)的各個不同振動能級，并以光的形式釋放出多余的能量，所發(fā)生的光即是熒光(圖1)。某些熒光物質(zhì)分子在降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級后，通過另一次無輻射躍遷降落至亞穩(wěn)的三重線態(tài)，又受到熱激活作用再回到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級，最后由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降落至電子基態(tài)而發(fā)出熒光。因此，產(chǎn)生熒光的第一個必要條件是該物質(zhì)的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構(gòu)，通常是共軛雙鍵結(jié)構(gòu)；第二個條件是該分子必須具有一定程度的熒光效率。

2 試驗及方法

2.1 試驗樣品

試驗用鮮牛奶購于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站牛奶廠；生物試劑維生素B2(VB2)、蒸餾水、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)均購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1 cm比色皿。

圖1 熒光光譜能級躍遷Fig.1 Fluorescence spectrum energy level transition

2.2 試驗儀器

采用日本島津RF-5301PC熒光分光光度計，以150 W的弧光氙燈作為發(fā)光光源，用1300刻線·毫米-1的光柵作為單色儀中分光元件，采用R3788型光電倍增管(PTM)作為光電探測器，掃描波長范圍為220～900 nm，波長精度為±1.5 nm，波長掃描速度3000 min-1，可通過500～650 nm的濾光片作為暢通濾光片,測得的數(shù)據(jù)經(jīng)RF-5301軟件實時采集、處理并輸出。

電子天平為上海精科FA1204B型，精度為0.1 mg。

2.3 樣品的制備

2.3.1 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

準(zhǔn)確稱取維生素B2對照樣品10 mg，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解維生素B2，定容至100 mL的棕色容量瓶中，其濃度為0.10 mg·mL-1，當(dāng)天配置，冰箱4℃保存，試驗時稀釋成不同的濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.3.2 不同環(huán)境下牛奶中維生素B2液體的配制

2.3.2.1 配制酸性環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別加入5 mL濃度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)鹽酸溶液提取，超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機(jī)微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進(jìn)行光譜測定。

2.3.2.2 配制堿性環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別加入5 mL濃度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)氫氧化鈉溶液提取，超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機(jī)微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進(jìn)行光譜測定。

2.3.2.3 在不同時間的光照環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別在陽光下照射5、10、15、20、25 h，然后超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機(jī)微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進(jìn)行光譜測定。

2.3.2.4 不同溫度下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別在20、40、60、80、100℃的水浴中放置3 h，超聲提取30 min后定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機(jī)微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進(jìn)行光譜測定。

3 熒光光譜數(shù)據(jù)處理

3.1 激發(fā)波長與發(fā)射波長的選擇

維生素B2標(biāo)準(zhǔn)制備液在不同的激發(fā)波長照射下，產(chǎn)生的熒光光譜強(qiáng)度(I)隨著激發(fā)光波長的增加而增加，對應(yīng)的熒光光譜的波段為500～610 nm。由圖2可見，當(dāng)激發(fā)光波長為370 nm時，熒光光譜中出現(xiàn)熒光強(qiáng)度最高的峰對應(yīng)的峰值波長是530 nm?？梢詳喽ňS生素B2溶液的最佳激發(fā)波長(λex)為370 nm，最佳發(fā)射波長(λem)為530 nm。

圖2 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)制備液的熒光光譜Fig.2 Fluoresecence spectra of aqueou solution of Vitamin B2

圖3 牛奶的熒光光譜Fig.3 Fluoresecence spectra of Mike

3.2 酸處理對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖4可見，隨著鹽酸濃度的增加，VB2的含量略有下降，表明鹽酸對牛奶中維生素B2的含量的影響較小，牛奶中維生素B2在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定。維生素B2在酸性環(huán)境下，產(chǎn)生了p-π共軛作用，增強(qiáng)了π電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大，使熒光增強(qiáng)。

3.3 堿處理對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖5可見，隨著氫氧化鈉濃度的增加，維生素B2的含量逐漸下降，表明氫氧化鈉對牛奶中VB2的含量影響較大，牛奶中維生素B2在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解破壞。其原因主要是減少了π電子的共軛度，同時增加了分子的內(nèi)轉(zhuǎn)換和系間跨越過程以及分子內(nèi)部的振動等非輻射躍遷的能量損失，減弱了熒光效率。分子結(jié)構(gòu)剛性減弱，共平面性減弱，熒光減弱。因此，隨著過氧化氫濃度的增加，過氧化氫的氧化性增強(qiáng)，將VB2氧化為其他物質(zhì)，致使牛奶中維生素B2的含量有所下降。

圖4 不同HCL濃度下牛奶中維生素B2的含量Fig.4 Vitamin B2concentration of Mike of different HCL concentration

圖5 不同NaOH濃度下牛奶中維生素B2的含量Fig.5 Vitamin B2concentration of Mike of different NaOH concentration

3.4 光照條件對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖6可見，隨著光照時間的延長，牛奶中VB2的含量逐漸下降，說明光照對牛奶中VB2的含量影響較大，即VB2對光敏感，易被分解破壞，物質(zhì)分子吸收輻射后，物質(zhì)分子的熒光產(chǎn)率必然由激發(fā)態(tài)分子之活化過程的各個相對速率決定。隨著光照時間的延長，一個原因是分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減小。因此，牛奶要避光保存。

圖6 光照下牛奶中維生素B2的含量Fig.6 Vitamin B2concentration of Mike of Light time

3.5 溫度對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖7可見，隨著溫度的升高，牛奶中VB2的含量漸有下降，說明溫度對牛奶中VB2的含量影響不大，即VB2對溫度不敏感。這主要是由于隨著溫度的升高，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度將減小，原因是分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量，導(dǎo)致VB2的含量減少。因此，溫度因素對牛奶的保存影響不太顯著。

圖7 不同溫度下牛奶中維生素B2的含量Fig.7 Vitamin B2concentration of Mike of different Temperature

4 結(jié)論

試驗采集的熒光光譜圖由大量的光譜數(shù)據(jù)構(gòu)成，為了更好的分析純牛奶在不同環(huán)境下樣品的光

譜特性，試驗通過利用Oirign7.5軟件對樣品熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。熒光光譜中激發(fā)光譜和發(fā)射光譜隨著熒光物質(zhì)的不同或物質(zhì)含量的不同，熒光強(qiáng)度也不同，所以定性鑒別和定量分析熒光物質(zhì)可從激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩方面著手處理。

利用熒光光譜檢測技術(shù)，對維生素B2純?nèi)芤杭芭Ｄ贪l(fā)射光譜特性和激發(fā)光譜特性進(jìn)行了詳細(xì)的對比研究，解釋了熒光光譜產(chǎn)生的原因以及對應(yīng)的熒光團(tuán)，并分析了純牛奶熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的機(jī)理。

研究了不同環(huán)境下牛奶的熒光光譜特性，分析了不同環(huán)境下牛奶中維生素B2含量的影響因素及原因。牛奶中維生素B2在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定；在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解破壞，對光敏感，對溫度不敏感，因此，牛奶要避光保存。

參 考 文 獻(xiàn)

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