張婉華,朱永軍,張春玲,何錫忠,彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106)

根據(jù)《獸藥注冊(cè)辦法》和農(nóng)業(yè)部442號(hào)、683公告精神[1～3]，獸用生物制品制造所用種毒應(yīng)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的鑒定，具有良好的免疫原性的繁殖特性，并具有明確的生物學(xué)特性和鑒別特性等。疫苗生產(chǎn)所用種毒，不僅直接影響到疫苗的質(zhì)量，而且關(guān)系到人畜的健康與安全，只有經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)合格的種毒，才可用于生產(chǎn)獸用生物制品。

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病因之一，可引起母豬尤其是初產(chǎn)母豬的繁殖障礙，表現(xiàn)為母豬受胎率降低，產(chǎn)活仔數(shù)減少和(或)出現(xiàn)死胎、木乃伊胎等[4]。目前預(yù)防該病的主要措施是疫苗預(yù)防接種。豬細(xì)小病毒病活疫苗具有良好的安全性和免疫效果，為了確保疫苗的質(zhì)量，生產(chǎn)用種毒的穩(wěn)定性至關(guān)重要，本試驗(yàn)對(duì)PPVS-1A株濕毒和凍干毒在-20℃和-70℃經(jīng)不同時(shí)間保存后，對(duì)其進(jìn)行了病毒含量、血凝價(jià)、安全性和免疫原性的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 ST細(xì)胞

由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 血清與培養(yǎng)基

新生牛血清和MEM粉，均由美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

2～4日齡健康乳鼠(每窩不少于5只，帶母鼠飼養(yǎng))、300～500 g健康青年豚鼠(HI抗體效價(jià)≤1∶8)，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 病毒含量測(cè)定

用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液將病毒液作10倍系列稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-6、10-7、 10-8、10-9等6個(gè)稀釋度，分別接種長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL，同時(shí)設(shè)細(xì)胞陰性對(duì)照孔。接種后，置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，觀察細(xì)胞病變(CPE)，出現(xiàn)CPE者判為感染，計(jì)算TCID50。樣品TCID50應(yīng)基本保持穩(wěn)定，無(wú)明顯變化。

1.5 HA和HI試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5]。樣品的HA、HI應(yīng)基本保持穩(wěn)定，無(wú)明顯變化。

1.6 種毒的安全檢驗(yàn)

每一樣品接種乳鼠一窩，皮下注射0.1 mL，觀察7 d，記錄乳鼠健活情況。乳鼠接種后應(yīng)不出現(xiàn)種毒注射導(dǎo)致的不良反應(yīng)。

1.7 種毒的免疫原性試驗(yàn)

每一樣品接種豚鼠5只，每只肌肉注射0.1 mL，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，接種后21 d，全部采血，檢測(cè)豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)。接種豚鼠后至少4只HI抗體不低于1∶32，對(duì)照組HI抗體應(yīng)全部不高于1∶8。

1.8 病毒

豬細(xì)小病毒PPVS-1A F10濕毒和凍干毒，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。PPVS-1A F10濕毒和凍干毒分別放置在-20℃和-70℃保存，每12個(gè)月取樣一次，每一樣品測(cè)定TCID50、HA，并將每一樣品接種乳鼠和豚鼠，觀察種毒的安全性和免疫原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPVS-1A株濕毒的保存期及免疫原性試驗(yàn)

由表1可見(jiàn)，在-20℃保存24個(gè)月和-70℃保存48個(gè)月，每一樣品其病毒含量在107.25～107.75，HA血凝價(jià)在1∶1024；乳鼠安全檢驗(yàn)均健活，未見(jiàn)不良反應(yīng)；豚鼠抗體檢測(cè)時(shí)，HI均不低于1∶32。而-20℃保存36個(gè)月和-70℃保存60個(gè)月，HA血凝價(jià)或豚鼠抗體效價(jià)檢測(cè)有所下降。

表1 PPVS-1A 株濕毒在不同溫度下保存的測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示HI抗體效價(jià)≤1∶8，表2同。

Note：“-” indicates antibody titer of HI ≤1∶8.The same as table 2.

2.2 PPVS-1A株凍干毒的保存期及免疫原性試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，在-20℃保存36個(gè)月和-70℃保存60個(gè)月，每一樣品其病毒含量和紅細(xì)胞凝集價(jià)均無(wú)明顯變化，病毒含量在107.25～107.75，HA血凝價(jià)1∶1024；乳鼠安全檢驗(yàn)均健活，未見(jiàn)不良反應(yīng)；豚鼠抗體檢測(cè)時(shí)，HI均不低于1∶32。而-20℃保存48個(gè)月和-70℃保存72個(gè)月，HA血凝價(jià)或豚鼠抗體效價(jià)檢測(cè)有所下降。

表2 PPVS-1A 株凍干毒在不同溫度下保存的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

為了防治動(dòng)物疾病，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，維護(hù)人體健康，農(nóng)業(yè)部加強(qiáng)了獸用生物制品的管理，于2004年11月農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第44號(hào)令《獸藥注冊(cè)辦法》[3]，2004年12月農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第442號(hào)公告《獸用生物制品注冊(cè)分類(lèi)及注冊(cè)資料要求》，2006年6月發(fā)布了683號(hào)公告《獸用生物制品試驗(yàn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，對(duì)獸用生物制品所用的菌種有明確的要求，根據(jù)公告要求，本試驗(yàn)進(jìn)行了種毒保存期試驗(yàn)，從源頭上保障豬細(xì)小病毒病疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量。

豬細(xì)小病毒病活疫苗生產(chǎn)用種毒PPVS-1A株濕毒在-20℃保存24個(gè)月、凍干毒保存36個(gè)月，濕毒在-70℃保存48個(gè)月、凍干毒保存60個(gè)月，病毒含量均大于107.25，HA血凝價(jià)在1∶1024；乳鼠接種未見(jiàn)不良反應(yīng)；豚鼠抗體檢測(cè)HI均不低于1∶32。PPVS-1A株的病毒含量、血凝價(jià)、毒力及免疫原性均比較穩(wěn)定，為疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量奠定了良好的基礎(chǔ)。

豬細(xì)小病毒用本動(dòng)物——豬做效力試驗(yàn)，價(jià)格昂貴，并需要一定的隔離飼養(yǎng)條件，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠替代豬，作為本試驗(yàn)的效力檢驗(yàn)，取得了理想的效果，且豚鼠作為豬細(xì)小病毒效力檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已得到證實(shí)[6,7]。作為生物制品研究與生產(chǎn)的重要原材料，種毒無(wú)論在新獸藥證書(shū)申報(bào)材料中還是對(duì)已有產(chǎn)品的GMP車(chē)間驗(yàn)收中都作為一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。本研究證明豬細(xì)小病毒病活疫苗生產(chǎn)用種毒PPVS-1A株，具有良好的安全性和免疫原性，可用于疫苗制備。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.獸用生物制品試驗(yàn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第683號(hào)，2006.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.獸用生物制品注冊(cè)分類(lèi)及注冊(cè)資料要求[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第442號(hào)，2004.

[3]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.獸藥注冊(cè)辦法[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部令第44號(hào)，2004.

[4]殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)(第2版)[M]．北京：科學(xué)出版社，1997：1150-1158.

[5]張婉華，鄒勇，朱永軍，等.豬細(xì)小病毒HA、HI微量法試驗(yàn)的優(yōu)化[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47(2)：21-23.

[6]張婉華，葉向陽(yáng)，徐平，等.用豚鼠效檢豬細(xì)小病毒病油乳劑滅活疫苗判斷標(biāo)準(zhǔn)的初步研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，20(1):120-122.

[7]盤(pán)寶進(jìn)，白安斌，姚瑞英，等.豚鼠對(duì)豬細(xì)小病毒弱毒苗抗體反應(yīng)的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24(6)：467-470.

[8]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局.獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范培訓(xùn)指南[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：413.