占鵬飛，徐森華，施國(guó)方，李玉峰，馮建琴，費(fèi)建明

（湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313000）

蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究進(jìn)展

占鵬飛，徐森華，施國(guó)方，李玉峰，馮建琴，費(fèi)建明

（湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313000）

蛹蟲草多糖作為一種生理活性物質(zhì)，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生各種免疫活性因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；還具有保護(hù)肝臟、腎臟、降血糖、抗衰老等作用，近年來(lái)日益受到人們的重視。本文概述了蛹蟲草多糖的提取方法及其免疫功能的研究狀況。

蛹蟲草多糖；提取；免疫功能

蛹蟲草（Cordyceps militaris），亦稱北冬蟲夏草，是寄生于夜蛾科等蛹體上的不同于冬蟲夏草的另一種蟲草。蛹蟲草的藥用價(jià)值較高，據(jù)《新華本草綱目》記載：“蛹蟲草味甘，性平，有益肝腎，補(bǔ)精髓，止血化痰功能?！庇嘘P(guān)研究表明，蛹蟲草含有蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物質(zhì)，蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素及對(duì)人體有益的微量元素含量也十分豐富［1，2］。

蛹蟲草中含有豐富的功能性成分蟲草多糖，現(xiàn)代免疫藥理學(xué)研究表明，蛹蟲草多糖能引起T淋巴細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化及增殖，并分泌各種淋巴因子。蟲草多糖主要是通過(guò)活化免疫因子和促進(jìn)細(xì)胞因子生成等途徑對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用［3-4］，多年來(lái)科學(xué)家對(duì)其提取、純化及應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究。本文就蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究作一概述。

1 蛹蟲草多糖的提取

1.1 一般提取法

多糖的提取通常采用水煮醇沉的常規(guī)方法，蛹蟲草多糖提取一般先用乙醚脫脂，再經(jīng)熱水提取、乙醇沉淀得粗多糖。不同研究者用的提取方法不同，所得粗多糖得率也不同，此提取方法簡(jiǎn)單、方便但所獲得的目標(biāo)產(chǎn)物純度不太高，需進(jìn)一步純化。

季暉等［5］取人工蟲草菌絲干粉200 g，經(jīng)100%乙醇、70%乙醇索氏提取后，殘?jiān)脽崴磸?fù)提?。?0 h×5次），提取液用自來(lái)水透析2 d，再用無(wú)離子水透析2 d，合并未透析部分稍加濃縮后，加入2倍體積的乙醇，離心收集乙醇沉淀，沉淀物用水洗滌濃縮后真空干燥，即得粗多糖，產(chǎn)率6.67%。

馬成堅(jiān)等［6］取蛹蟲草膠囊粉末100 g，置于索氏提取器中，加無(wú)水乙醚100 ml于圓底燒瓶中，連續(xù)回流提取至無(wú)色。藥渣風(fēng)干后用8倍量沸水回流提取2次，每次30 min，趁熱過(guò)濾，合并濾液，并將濾液濃縮至15 ml，加乙醇至含醇量80%，于冰箱中靜置過(guò)夜，離心過(guò)濾，并加0.2%活性炭脫色。沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙醇依次洗滌3次，每次5 ml，置60℃烘干，得灰白色粗多糖。

姚桂卿等［7］取無(wú)雜菌的蛹蟲草發(fā)酵物壓濾，將菌絲體與發(fā)酵液分開，菌絲體加5倍體積的水，90℃～95℃浸煮10 h，浸煮4～5次，浸煮液抽濾，濾液合并，減壓濃縮至一定體積，離心棄去濾渣，向上清液中加3倍體積95%乙醇沉淀過(guò)夜，離心，收集沉淀，加丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，然后置真空干燥器中抽真空干燥，得粗多糖黃色粉末，得率2.8%。鐘艷梅等［8］對(duì)蟲草發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎、脫脂、樹脂處理后，進(jìn)行索氏提取，并除雜、濃縮、離子交換柱分離后確定了最佳的提取分離條件：料水比為1∶16，離子柱pH為3.5，洗脫流速為1滴/s。

袁建國(guó)等［9］對(duì)蟲草多糖的提取進(jìn)行了研究，研究表明分步提取，提取率可達(dá)85%以上，將提取液濃縮加入3倍體積的95%工業(yè)酒精，攪拌靜止沉淀，離心，收集沉淀物。該沉淀物脫水、烘干，得棕褐色粉末狀粗多糖；將粗多糖加水溶解、過(guò)濾，取蟲草多糖清液，調(diào)節(jié)濃度至10～15%，通過(guò)交換樹脂處理，收集多糖部分液體，將其真空濃縮加酒精沉淀，經(jīng)脫水，干燥后即為脫鹽蟲草多糖。

魯曉巖［10］將子實(shí)體干燥樣品磨碎，索氏抽提后，抽提液加活性碳脫色，過(guò)濾，80℃水浴濃縮后，加乙醇配置成80%乙醇液，冰箱靜置，過(guò)濾，洗滌，將沉淀溶解于80℃水中，然后冷卻再采用Sevag法反復(fù)去蛋白，于水浴上揮發(fā)去有機(jī)相，冷卻，定容后得到多糖產(chǎn)品。

余曉斌等［11］通過(guò)SAS-RSREG程序計(jì)算出回歸方程中各系數(shù)，然后以蟲草多糖沉析量回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，確定了乙醇，發(fā)酵液（體積比）為3.8∶1，醇析時(shí)間為11.7 h，pH值為7.65，蟲草多糖醇析量為11.35 s/L。

1.2 微波輔助提取法

微波輔助提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物提取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)。比索氏提取法用時(shí)短；比超臨界提取法所需的設(shè)備要求低。

譚放等［12］從蛹蟲草深加工綜合利用的角度，利用微波輔助提取多糖，重點(diǎn)考察了液料質(zhì)量比、提取時(shí)間、微波功率、物料粒度等因數(shù)對(duì)多糖提取效果的影響，將蛹蟲草粉先脫脂再微波提取、濃縮、脫色、沉析、過(guò)濾、干燥最終得到蟲草多糖，得到了微波場(chǎng)協(xié)同提取蛹蟲草多糖的最佳工藝條件，具體工藝如下：稱取50 g蛹蟲草粉，用石油醚脫脂后，晾干，加入450 g水，靜置10 min濕潤(rùn)物料，微波450 w輻射1 min，間隔1 min后再輻射1 min，如此問(wèn)隔輻射直至總輻射時(shí)間達(dá)到4 min，過(guò)濾。按同樣條件重復(fù)提取操作1次。合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮到100 ml左右，加入95%的乙醇450 ml以析出沉淀，過(guò)濾，用乙醇洗滌多次，沉淀真空干燥后即得多糖，產(chǎn)率15.2%，多糖含量61.6%。結(jié)果表明微波場(chǎng)對(duì)蛹蟲草多糖的提取明顯的協(xié)同作用，能降低提取劑的用量、縮短提取時(shí)問(wèn)和提高多糖產(chǎn)率，具有省時(shí)、高效、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，從而降低提取成本，在很多方面優(yōu)于傳統(tǒng)的直接加熱提取法。

2 蛹蟲草多糖的免疫功能

蛹蟲草多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和提高免疫能力等多種藥理活性，其治療慢性腎炎、急慢性腎功能衰竭、肝損傷、腫瘤、高血脂和高血糖等多種疾病的功用引起眾多學(xué)者的關(guān)注。

2.1 蛹蟲草多糖對(duì)免疫器官的作用

鄭賢林等［13］用氫化可的松造模肝損傷小鼠，使其血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxaloacetic transami?nase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transami?nase，ALT）活性顯著升高，通過(guò)灌胃給予蛹蟲草菌絲體多糖，發(fā)現(xiàn)小鼠血清AST和ALT活性顯著下降，且呈劑量相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)表明蛹蟲草多糖可明顯提高抗氧化劑的水平，降低肝組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，從而減輕了因脂質(zhì)過(guò)氧化加劇而造成的肝細(xì)胞損傷；肝臟石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖明顯減輕了氫化可的松引起的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇淤血及肝索排列紊亂等病理變化，顯示出其對(duì)氫化可的松造成的肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。黃軍民、盧建華［14］在四氯化碳（CCl4）損傷的肝細(xì)胞中加入蟲草多糖后，發(fā)現(xiàn)隨著劑量加大，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的肝酶活性逐漸降低，提示其能減輕肝細(xì)胞損傷，減少ALT與AST的釋放；并且CP能降低肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量，提示CP能有效對(duì)抗CCl4引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成。

呂小波等［15］研究發(fā)現(xiàn)：蟲草多糖能提高慢性腎功能衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶（Superoxide Dis?mutase，SOD酶）活力，同時(shí)降低MDA含量，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而有效預(yù)防慢性腎功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展，改善腎功能，糾正代謝紊亂，促進(jìn)腎單位的修復(fù)與再生。尹鴻萍等［16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多糖能夠防治腺嘌呤誘發(fā)的慢性腎功能衰竭，有效預(yù)防慢性腎衰的發(fā)生、發(fā)展，改善腎功能。陳濤等［17］發(fā)現(xiàn)蟲草多糖能夠治療大鼠腎臟部分切除誘發(fā)的慢性腎功能衰竭，改善腎功能，試驗(yàn)證實(shí)蛹蟲草子實(shí)體中多糖組分能顯著降低慢性腎衰竭大鼠血尿素氮、肌酐，明顯減輕腎臟的病理?yè)p害。

2.2 蛹蟲草多糖對(duì)細(xì)胞因子的作用

細(xì)胞因子是指在細(xì)胞間傳遞信息、對(duì)細(xì)胞起活化作用、并可由多種細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性多肽分子。蛹蟲草多糖在促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生方面所起的作用日益受到人們的重視。

靖大道等［18］研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多糖可單獨(dú)或協(xié)同植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）誘導(dǎo)人白介素2受體（Interleukin-2，IL-2R）的表達(dá)，促進(jìn)可溶性IL-2R的生成，但對(duì)PHA誘生的IL-2、干擾素-γ Interferon-γ，IFN-γ）活性有選擇性抑制作用，其協(xié)同或抑制作用均呈劑量依賴性。有關(guān)研究表明，蛹蟲草多糖在10～50 mg/L濃度時(shí)能刺激人外周血單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），在0.1～10 mg/L濃度時(shí)能刺激單核細(xì)胞生成可溶性白細(xì)胞介素-2受體（Soluble interleukin-2 re?ceptor，SIL-2R），且在一定的濃度范圍內(nèi)，TNF-γ及SIL-2R的水平隨北蟲草多糖濃度的增加而升高［19］。

方步武等［20］用蛹蟲草多糖治療牛血清白蛋白免疫損傷肝纖維化模型大鼠，結(jié)果表明其能顯著減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor-p，TGF-p）生成與分泌，能夠明顯降低TGF-p mRNA表達(dá)。蟲草多糖正是通過(guò)影響細(xì)胞之間的傳遞介質(zhì)——細(xì)胞因子來(lái)增加機(jī)體內(nèi)抗體（如免疫球蛋白G和免疫球蛋白M）的含量［21］。

2.3 蛹蟲草多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫作用

蛹蟲草多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫作用也是蟲草多糖研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Zhans等［22］觀察到蛹蟲草多糖能顯著增強(qiáng)移植了B16黑素瘤株小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，顯著抑制B16細(xì)胞向肝肺轉(zhuǎn)移。

袁建國(guó)等［23］將S180瘤株配成生理鹽水液，小鼠右前肢腋窩下皮下接種，連續(xù)9 d蛹蟲草多糖灌胃給藥，每日1次，環(huán)磷酰胺腹腔注射，隔日1次，連續(xù)給藥5次，末次給藥6 h后剖取腫瘤稱重，蟲草多糖375 mg/kg時(shí)抑瘤率可達(dá)45.71%，750 mg/kg蟲草多糖與45 mg/kg環(huán)磷酰胺共同作用比單獨(dú)使用環(huán)磷酰胺抑瘤率提高6．84%。趙躍然等［24］以荷瘤BALB/c小鼠為模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲草多糖依量效關(guān)系明顯抑制S180腫瘤生長(zhǎng)，增加外周血酸性α-醋酸萘酯酶（Acid αnaphthyl acetate esterase，ANAE）細(xì)胞百分率，增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Delayed type hypersensitivity，DTH）及膜輔因子蛋白（Membrane cofactor protein，Mcp）的吞噬活性。藏其中等［25］研究發(fā)現(xiàn)蟲草多糖對(duì)S180細(xì)胞的抑制率為16～33%。至于蟲草多糖抑制腫瘤的作用機(jī)制，有研究認(rèn)為是通過(guò)刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生和激活免疫細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的，也有認(rèn)為蟲草多糖類成分具有促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖、分泌，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能，是通過(guò)宿主介導(dǎo)而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，免疫逃逸是機(jī)體免疫功能喪失對(duì)腫瘤細(xì)胞監(jiān)視作用的重要原因，免疫逃逸現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于腫瘤細(xì)胞分泌一種抑制物質(zhì)，使其主要組織相容性復(fù)合物（Major histoeompatibility complex，MHC）基因表達(dá)下調(diào)，或?qū)λ拗鱐細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子反應(yīng)性下降所致。冬蟲夏草提取物可提高腫瘤細(xì)胞表面型MHC的表達(dá)，使宿主免疫可對(duì)MHC-型抗原表達(dá)下調(diào)的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮有效的免疫監(jiān)視作用［26］。

2.4 蛹蟲草多糖的抗氧化及延緩衰老的作用

蛹蟲草多糖能顯著增強(qiáng)肝臟SOD酶活性，促進(jìn)SOD酶活力，有明顯的抗氧化、清除氧自由基和羥自由基的作用，對(duì)延緩衰老有顯著意義［27］。研究證實(shí)，蛹蟲草多糖能促進(jìn)SOD酶活力，具有明顯抗衰老作用。對(duì)老年性癡呆的有效率為37.14%，明顯優(yōu)于維生素E同時(shí)能提高老齡大鼠SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和明顯降低體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，從而提示蛹蟲草多糖的抗衰老作用是通過(guò)抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的。

李連德等［28］采用從蛹蟲草深層發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖進(jìn)行果蠅抗衰老試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同來(lái)源的蟲草多糖對(duì)果蠅壽命均有不同程度的延長(zhǎng)作用，從而證明蟲草多糖有延緩衰老的作用。有的效果還十分顯著，來(lái)源于地生枝頂孢的胞內(nèi)、胞外多糖效果最好，并且延壽的效果隨純度的增大而提高。王菊鳳等［29］研究了蛹蟲草多糖對(duì)果蠅種群期望壽命的影響。結(jié)果表明：蛹蟲草多糖能顯著提高果蠅種群的期望壽命。0.15%濃度組在果蠅的各個(gè)年齡階段的生命期望值都比對(duì)照組相應(yīng)的年齡階段高出30%以上，50 d年齡組高出70%多；60 d年齡組則高出100%；且用各種濃度的蛹蟲草多糖喂養(yǎng)的果蠅在老齡后生命力很強(qiáng)，說(shuō)明蛹蟲草多糖對(duì)老齡果蠅的生命有明顯促進(jìn)作用。

蛹蟲草多糖對(duì)皮膚光老化具有保護(hù)作用［30］。皮膚老化是機(jī)體衰老的重要組成部分，它包括兩個(gè)過(guò)程：內(nèi)在老化和光老化。蛹蟲草多糖可以使皮膚真皮層厚度保持正常水平，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，阻止皮脂腺不規(guī)則地增生和纖維組織的疏松紊亂和斷裂，維持正常的纖維細(xì)胞形態(tài)，防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，使羥脯氨酸含量及膠原蛋白含量明顯增加，從而維持皮膚的光澤及彈性，延緩衰老。李華等［31］用8-甲氧補(bǔ)骨脂素聯(lián)合紫外線制備皮膚成纖維細(xì)胞氧化模型，探討了蛹蟲草多糖對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化能力的影響。通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組、模型組和蛹蟲草多糖保護(hù)組的細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、過(guò)氧化氫酶（Cata?lase，CAT）、GSH-Px含量和測(cè)定線粒體跨膜電位的破壞情況，發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞的自由基含量較對(duì)照組增多，自由基清除酶系統(tǒng)活力下降，蛹蟲草多糖保護(hù)組的自由基含量較模型組低，自由基清除能力也有所改善；線粒體跨膜電位的破壞程度也有所改善。表明蛹蟲草多糖可通過(guò)保護(hù)線粒體功能增加皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化能力，可能為蛹蟲草多糖抗光老化的機(jī)制之一。

3 前景與展望

蛹蟲草作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴的強(qiáng)壯滋補(bǔ)品，在歷史上很早就引起重視和應(yīng)用，近年來(lái)由于國(guó)家的重視和商業(yè)經(jīng)濟(jì)的需求，對(duì)蛹蟲草的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用取得了迅速的發(fā)展。蛹蟲草多糖作為蟲草中含量最高的生理活性物質(zhì)，也是其主要活性成分之一，所以隨著對(duì)蛹蟲草多糖研究的不斷深入，利用蛹蟲草多糖開發(fā)的功能性食品添加劑、保健品或藥品的市場(chǎng)前景為人們所看好。對(duì)蛹蟲草多糖開展的研究，雖然分離純化的多糖各不相同，但都從不同角度肯定了蛹蟲草多糖的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、保護(hù)腎臟、肝臟、延緩衰老、抗疲勞等功能，因此，蛹蟲草多糖被業(yè)內(nèi)認(rèn)為是較好的免疫促進(jìn)劑之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用家蠶、蠶蛹培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體成為獲取蛹蟲草多糖的一條新的途徑。因此，蛹蟲草多糖用于保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品有著廣泛的前景，并將為人類的健康長(zhǎng)壽發(fā)揮出重要作用。

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Research Progress on Polysaccharide Extraction of Cordyceps Militaris and Immune Function

ZHAN Peng-fei,XU Sen-hua,SHI Guo-fang,LI Yu-feng,FENG Jian-qin,FEI Jian-ming
（Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China）

Polysaccharide of ccordyceps militaris is a kind of physiological active substances,which can promote prolifer?ation and differentiation of T lymphocytes,macrophages and white blood cells and protect liver,kidney,hypoglycemic, anti-aging effect.In recent years,researcher paid more and more attention on it.This paper outlined the methods extrac?tion and immune function.of polysaccharide of cordyceps militaris.

polysaccharide of cordyceps militaris;extraction;immune function

S886.9

A

0258-4069［2014］02-010-05

湖州市自然科學(xué)資金項(xiàng)目（2012YZ02）

占鵬飛（1982-），男，江西上饒人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事家蠶新技術(shù)、新資源開發(fā)研究等。E-mail：fei2533817@163.com