董 婧，李 林，于業(yè)輝，董曉慶，陳玉珂，裴懷全，王秋舉，張東鳴

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

L-肉堿(L-carnitine)最主要的生理學(xué)功能是參與長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化，輔助脂酰CoA通過電位差陰離子通道進(jìn)入線粒體基質(zhì)，最終釋放出?；鵆oA參與β-氧化，產(chǎn)生ATP[1]。L-肉堿對(duì)魚類的作用有促生長(zhǎng)，促脂肪酸氧化，節(jié)約蛋白質(zhì)，減少氨排泄、抵抗氨及外源性化合物的毒性，有助于適應(yīng)極端水溫的應(yīng)激、提高高水平運(yùn)功能力，改變肌肉組成、提高生殖能力[2]。但研究結(jié)果并非都是積極的，在過去的20年，研究者一直在探討動(dòng)物飼料中是否需要添加外源肉堿。Dias等[3]研究表明，L-肉堿對(duì)歐洲黑鱸(Dicentrarchuslabrax)無促生長(zhǎng)、促脂肪酸氧化作用；Selcuk等[4]對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究結(jié)果也無促生長(zhǎng)、促脂肪酸氧化作用；而 Ozório[5]綜述了L-肉堿添加的積極作用，并分析了其作用效果的影響因素，結(jié)果表明外源性添加L-肉堿可以促進(jìn)脂肪作為能量來源，通過調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的活性，來維持機(jī)體脂肪代謝的動(dòng)態(tài)平衡。

肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(carnitine palmitoyltransferase I，CPT I)是線粒體脂肪酸氧化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，對(duì)脂肪的分解供能具有重要的調(diào)控作用。目前，對(duì)于人和哺乳動(dòng)物的CPTI基因已有較多研究。CPTI與機(jī)體脂肪沉積有密切的關(guān)系，其表達(dá)水平與機(jī)體脂肪含量相關(guān)，表達(dá)水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低機(jī)體脂肪含量[6]。由于CPT I在能量代謝中的重要作用，其與心肌肥厚、糖尿病等許多代謝疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[7]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控CPT I活性的因子有很多，如丙二酰CoA(M-CoA)的變構(gòu)抑制、CPTI基因與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的變化以及線粒體外膜的脂類組成及其流動(dòng)性等[8-9]。營(yíng)養(yǎng)素可以影響CPT I活性并最終影響線粒體脂肪酸的β-氧化[10]。在對(duì)虹鱒的研究中發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸可以通過改變線粒體膜的組成間接影響CPT I的活性，且飼料中的脂肪酸主要是通過調(diào)控CPTI基因的表達(dá)從而影響機(jī)體脂肪酸的氧化[11]?；虮磉_(dá)對(duì)酶活性的調(diào)控及功能的實(shí)現(xiàn)成為營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的一大研究熱點(diǎn)。而魚類CPTI基因表達(dá)的研究報(bào)道還很少，而且L-肉堿對(duì)CPTI基因表達(dá)的調(diào)控及對(duì)脂肪酸氧化的作用機(jī)制也未見報(bào)道。

本試驗(yàn)選擇鯉魚幼魚為研究對(duì)象，在飼料中添加不同含量的L-肉堿，研究其對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成的影響；采用RT-PCR技術(shù)克隆鯉魚CPTI基因的部分cDNA序列，評(píng)估L-肉堿對(duì)鯉魚背肌中CPTI基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步探討肉堿調(diào)控CPTI基因功能，作用機(jī)理及L-肉堿添加問題提供參考資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

用于CPTI基因克隆的鯉魚(Cyprinuscarpio)(750～800 g/尾)購于遼寧沈陽東陵路沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)食品市場(chǎng)，4尾試驗(yàn)魚購回后立即解剖取其背部白肌，液氮澆凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼養(yǎng)試驗(yàn)用魚購于遼寧省大伙房水庫壩下魚種場(chǎng)，挑選體質(zhì)量為(2.5±0.5) g/尾的鯉魚幼魚540尾，隨機(jī)分到18個(gè)150 cm×60 cm×80 cm的水族箱中，用加熱棒將水溫控制在(26±1) ℃，光周期為12L/12D。按鯉魚幼魚營(yíng)養(yǎng)要求配制試驗(yàn)配方，L-肉堿添加量分別為0，50，100，150，200，400 mg/kg，基礎(chǔ)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。原料經(jīng)粉碎過60目(孔徑250 μm)篩，按配方稱質(zhì)量，逐級(jí)混勻，擠壓成直徑1.0 mm的顆粒，在60 ℃恒溫箱中經(jīng)5 h烘干后置于-4 ℃冰柜中保存、備用。

飼養(yǎng)試驗(yàn)前用對(duì)照組飼料馴養(yǎng)15 d后分組，共設(shè)6個(gè)處理組，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。分組后預(yù)飼1周，然后開始60 d的正式試驗(yàn)，分組前用10～20 mg/L的高錳酸鉀水溶液藥浴，試驗(yàn)期間平均水溫(26±1) ℃，溶解氧≥5 mg/L，pH 7～8，NH3-N≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L。每天早上吸污后，換水1/3(經(jīng)空氣泵充分曝氣1 d的自來水，且與玻璃缸中的水溫保持一致)并記錄水溫。日投餌率視魚群攝食情況變動(dòng)于3%～6%，日投餌3次(08:00，13:00，18:00)，投餌方法為人工手撒。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每缸隨機(jī)取4尾魚，取其背部白肌放入凍存管中，用液氮澆凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 基礎(chǔ)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分

主要試劑：L-肉堿，購于Sigma公司，貨號(hào)C0158，純度≥98%；脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma公司，產(chǎn)品代號(hào)18919；氯仿、甲醇、正己烷、石油醚、氫氧化鉀、異丙醇、無水乙醇等，均為分析純?cè)噭?；RNAiso Plus試劑盒，TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa；DreamTagTMGreen PCR Master Mix(2X)，F(xiàn)ermentas；SybrGreen qPCR Master Mix(2X)，ABI。

主要儀器：離心濃縮儀，配有真空泵以及110 V變壓器；XHF-D高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī))；HP7890型氣相色譜儀(帶有氫火焰離子化檢測(cè)器，F(xiàn)ID)；HP化學(xué)工作站；彈性石英毛細(xì)管柱(DB23 30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm,安捷倫公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電子分析天平；ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 鯉魚背肌脂肪酸組成的測(cè)定

將鯉魚背肌樣品用研缽研磨成粉末，放入50 mL離心管中，加入氯仿與甲醇混合液(體積比2∶1)15 mL和蒸餾水5 mL，用高速分散器混合均勻，離心(3 500 r/min)20 min，小心取出底層液體放入15 mL玻璃管中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h左右，然后加入1 mL正己烷將粗脂肪溶解，再加入KOH-CH3OH(2 mol/L)0.2 mL，50 ℃水浴10 min，水浴結(jié)束后加50 mL/L的硫酸-甲醇0.2 mL輕輕混勻后離心(2 000 r/min)10 min，吸出上層脂肪酸于15 mL玻璃管中，放入離心濃縮儀蒸干，除去氯仿，最后將干燥后的脂肪酸用適量正己烷溶解，移入進(jìn)樣瓶供氣相色譜(GC)分析用。

GC分析的色譜條件：進(jìn)樣1 μL；進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測(cè)溫度270 ℃；柱升溫程序：初始溫度150 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升到230 ℃，保持20 min；氫氣和空氣流量分別為30和400 mL/min；載氣為N2，流量為1.5 mL/min。色譜峰的定性采用脂肪酸標(biāo)樣標(biāo)定，統(tǒng)計(jì)脂肪酸含量，分析其組成。

1.3 鯉魚CPT I基因克隆及序列分析

根據(jù)GenBank中斑馬魚(Daniorerio，BC083470.1)、虹鱒(AF327058.3)、鮭魚(Salmosalar，AM230810.1)等的CPTI保守序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CPTI基因上下游引物和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物，在上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表2)。RNAiso Plus試劑盒提取鯉魚背部白肌的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。取1 μL提取的總RNA進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL ：ddH2O 10 μL，DreamTagTMGreen PCR Master Mix (2X)35 μL，cDNA 2.5 μL，CPTI基因上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化測(cè)序。所得序列通過BLASTN進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用DNAMAN、MEGA4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的翻譯和比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

表 2 CPT I基因克隆及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CPT I基因的表達(dá)

提取鯉魚背部白肌總RNA，嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)利用ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL：10 μmol/L實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上、下游引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL，SybrGreen qPCR Master Mix(2X) 10 μL，滅菌水7 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值，計(jì)算出目標(biāo)基因CPTI和內(nèi)參基因18S rRNACt值的差異ΔCt；以差異最大的樣本作為參照樣本，計(jì)算出不同樣品相對(duì)于參照樣本基因的表達(dá)倍數(shù)2ΔΔCt，從而制作相對(duì)定量的圖表。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan多重比較法分析試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源肉堿對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成的影響

飼料中外源肉堿添加量對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成的影響見表3。

表 3 飼料中外源肉堿添加量對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成的影響

由表3可以看出，外源肉堿對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成有顯著影響(P<0.05)。隨飼料中L-肉堿添加量的增加，鯉魚背肌∑SFA和∑MUFA脂肪酸含量升高，∑PUFA、EPA(C20:5n-3)、DHA(C22:6n-3)、∑n-3和∑n-6脂肪酸含量降低。當(dāng)L-肉堿添加量分別為100，150，200，400 mg/kg時(shí)，與空白對(duì)照組(0 mg/kg)相比，∑SFA和∑MUFA含量顯著升高(P<0.05)；∑n-6和EPA含量顯著下降(P<0.05)。飼料中L-肉堿添加量為50，100，150，200，400 mg/kg時(shí)，鯉魚背肌∑PUFA、∑n-3、DHA脂肪酸含量較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。飼料中L-肉堿添加量為150，200，400 mg/kg時(shí)，鯉魚背肌∑PUFA和∑n-3脂肪酸含量較添加量為50，100 mg/kg組顯著降低(P<0.05)，但各組間差異不顯著。

2.2 鯉魚CPT I基因部分cDNA的克隆與序列分析

用RNAiso Plus試劑盒提取鯉魚背肌總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)CPTI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條特異的擴(kuò)增條帶，測(cè)序得其大小為857 bp，與預(yù)期片段大小一致。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序得其核苷酸和蛋白序列如圖1所示。運(yùn)用DNAMAN軟件，對(duì)獲得的鯉魚CPTI基因核苷酸序列與斑馬魚(NM_001005940.1)、虹鱒(NM_001171855.1)CPTI基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明其同源性分別為89%和79%，可初步確定所得序列為鯉魚CPTI基因的部分序列。

圖1 鯉魚背肌CPT I基因的部分cDNA及氨基酸序列

利用獲得的鯉魚(GenBank：AFC88887.1)CPTI基因與人類(Homosapiens，GenBank：NP_001027017.1和NP_004368.1)、獼猴(Macacamulatta，GenBank：XP_001101846.1)、褐家鼠(Rattusnorvegicus，GenBank：NP_113747.2)、羊(Ovisaries，GenBank：NP_001009259.1)、牛(Bostaurus，GenBank：NP_001029521.1)、蟾蜍(Xenopustropicalis，GenBank：NP_001072766.1)、斑馬魚(GenBank：NP_001005940.1)、虹鱒(GenBank：NP_001118207.1)、鯛魚(Sparusaurata，GenBank：ABI79327.1)等物種CPTI基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示，本試驗(yàn)獲得的鯉魚CPTI基因與斑馬魚等魚類的CPTI基因聚類在一起，隨后共同聚類為CPTIB群，推測(cè)其為CPTIB亞型。

圖2 鯉魚背肌CPT I基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 外源肉堿對(duì)鯉魚背肌CPT I基因mRNA表達(dá)豐度的影響

圖3表明，鯉魚飼料中L-肉堿添加量為150 mg/kg時(shí)，鯉魚背肌CPTI基因表達(dá)豐度最高，為對(duì)照組的4倍；L-肉堿添加量為150 和200 mg/kg時(shí)表達(dá)量差異不顯著，但與其他試驗(yàn)組相比差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；空白對(duì)照組(0 mg/kg)鯉魚背肌CPTI基因mRNA的表達(dá)豐度最低，顯著低于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)。

圖3 不同添加量的L-肉堿對(duì)鯉魚背肌CPT I基因mRNA表達(dá)豐度的影響柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

魚體肌肉組織中的脂肪酸構(gòu)成由飼料成分、魚體對(duì)脂類的消化吸收和代謝作用等因素共同決定。肉堿被稱之為“條件性必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”，其對(duì)脂肪酸的正常代謝極為重要。脂肪酸是機(jī)體組織的主要能量來源，線粒體外膜上被活化的長(zhǎng)鏈脂肪酸由肉堿介導(dǎo)通過線粒體內(nèi)膜進(jìn)行β-氧化，產(chǎn)生ATP供能。另外，細(xì)胞器內(nèi)脂?；耐耆罨c跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)均需要細(xì)胞內(nèi)肉堿的參與。Ozório[5]提出，在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下，魚類體內(nèi)合成的肉堿能夠滿足生長(zhǎng)需求，而外源性添加肉堿可以促進(jìn)脂肪作為能量來源，表明肉堿可通過調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的活性，來維持機(jī)體脂肪代謝的動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源肉堿對(duì)鯉魚背肌脂肪酸組成有顯著影響(P<0.05)，隨飼料中L-肉堿添加量的增加，鯉魚背肌∑SFA和∑MUFA脂肪酸含量顯著升高(P<0.05)，∑PUFA、EPA、DHA、∑n-3和∑n-6脂肪酸含量顯著降低(P<0.05)，這與Chatzifotis等[12]的研究結(jié)果一致。Jalali Haji-abadi等[13]研究指出，在虹鱒飼料中添加肉堿可以降低∑n-3的含量，飼喂1 000 mg/kg肉堿時(shí)，肌肉組織中的EPA和DHA含量均下降。Ozório[14]研究表明，非洲鯰魚(Clariasgariepinus)飼喂肉堿后對(duì)其肌肉中的∑n-3和∑n-6長(zhǎng)鏈脂肪酸含量影響不顯著。Nogueira等[15]研究顯示，在紅鯛(Pagruspagrus)飼養(yǎng)試驗(yàn)中，添加肉堿可以降低機(jī)體組織中的∑n-6和C18:3n-3含量，而對(duì)EPA和DHA含量影響不大。同時(shí)，Ozório等[16]研究指出，外源肉堿的添加促進(jìn)了長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化。PUFAs在生物體中的合成轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的過程。脂肪酸在機(jī)體內(nèi)保留的百分值反映了PUFA的合成能力。低百分值的脂肪酸是魚類優(yōu)先進(jìn)行氧化利用的，高百分值的脂肪酸則相反，被選擇性的沉積下來。本試驗(yàn)結(jié)果與研究對(duì)象的生長(zhǎng)階段是有一定關(guān)系的，推測(cè)外源性肉堿的添加使PUFA的利用大于合成，其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

CPTI基因位于線粒體外膜的內(nèi)側(cè)，催化脂酰CoA轉(zhuǎn)化為脂酰肉堿，通過線粒體內(nèi)膜運(yùn)送脂酰基進(jìn)行β-氧化，是線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶，其對(duì)機(jī)體的能量代謝起著重要的調(diào)控作用。水產(chǎn)動(dòng)物中，目前僅有虹鱒、斑馬魚、鮭魚、金頭鯛(Sparusaurata)的CPTI基因全序列或部分序列，而對(duì)其基因型的報(bào)道僅見于虹鱒和金頭鯛[9,17-19]。本研究對(duì)鯉魚CPTI基因部分cDNA序列進(jìn)行了克隆及分析，為其在鯉魚脂肪代謝中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。將試驗(yàn)獲得的CPTI基因片段同GenBank上發(fā)表的斑馬魚和虹鱒的CPTI基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明其同源性分別為89%和79%，表明所得CPTI基因片段具有較高的保守性。通過序列比對(duì)分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建，推測(cè)獲得的CPTI基因序列為肌肉亞型(CPTIB)。Harpaz[2]綜述了肉堿對(duì)魚類的作用，其中對(duì)魚類肉堿水平與CPT I活性相互關(guān)系的報(bào)道非常少，肉堿調(diào)控脂肪酸代謝的機(jī)理目前并不清楚。田娟等[20]研究表明，隨草魚(Ctenopharyngodonidella)飼料中L-肉堿添加量的增加，脂肪代謝過程中的分解酶活性升高，合成酶活性降低，使得腸系膜、肌肉和肝胰臟脂肪含量下降。高小強(qiáng)等[21]研究表明，牙鲆(Paralichthysolivaceus)飼料中添加適量的L-肉堿可加速脂肪酸氧化，提高能量利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，但劑量過高可能會(huì)抑制機(jī)體內(nèi)參與脂肪酸氧化過程的各種酶的活性，降低營(yíng)養(yǎng)利用率，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降。Yang等[22]研究表明，銀鱸(Bidyanusbidyanus)飼料中添加L-肉堿能夠降低銀鱸的腹脂率和機(jī)體的脂肪含量。

目前已知的魚類CPTI基因序列非常少，關(guān)于肉堿對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物CPTI基因表達(dá)水平的影響目前尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，鯉魚飼料中的L-肉堿添加量為150 mg/kg時(shí)，CPTI基因mRNA 的表達(dá)豐度最高，是對(duì)照組的4倍；L-肉堿添加量為150和200 mg/kg時(shí)差異不顯著，但與其他試驗(yàn)組相比有顯著差異(P<0.05)；空白對(duì)照組(0 mg/kg)CPTI基因mRNA 的表達(dá)豐度最低，且顯著低于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)，推測(cè)適量添加L-肉堿可以提高CPTI基因的表達(dá)水平及活性，這可以合理解釋田娟等[20]、高小強(qiáng)等[21]的研究結(jié)論。推測(cè)外源肉堿的添加可能提高了機(jī)體組織中的肉堿水平，作為酶作用底物提高了CPT I的活性及基因表達(dá)水平，促進(jìn)了長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化，有效調(diào)控了機(jī)體各組織中脂肪酸含量的變化。本試驗(yàn)中CPTI基因mRNA 的表達(dá)豐度與背肌脂肪酸組成的變化兩者之間是有關(guān)系的，但其相關(guān)性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。CPTI基因表達(dá)在脂類氧化中非常重要，脂類氧化的調(diào)控機(jī)制有助于更好地保護(hù)組織代謝，以免受生理和外界環(huán)境的刺激。了解CPTI基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制才能找到調(diào)節(jié)肉堿作用的影響因素，以更好地解釋飼料中添加L-肉堿的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的矛盾結(jié)果，有利于更加科學(xué)合理地將L-肉堿用于動(dòng)物產(chǎn)品的生產(chǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kerner J,Hoppel C.Fatty acid import into mitochondria [J].Biochim Biophys Acta,2000,1486:1-17.

[2] Harpaz S.L-carnitine and its attributed functions in fish cultureand nutrition：A review [J].Aquaculture,2005,249:3-21.

[3] Dias J,Arzel J,Corraze G,et al.Effects of dietary L-carnitine supplementation on growth and lipid metabolism in European seabass (Dicentrarchuslabrax) [J].Aquaculture Research,2001,32:206-215.

[4] Selcuk Z,Tiril S U,Alagil F.Effects of dietary L-carnitine and chromium picolinate supplementations on performance and some serum parameters in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].Aquac Int,2010,18(2):213-221.

[5] Ozório R O A.Dietary L-carnitine supplementation to cultivated fish:A mini-review [J].Curr Nutr Food Sci,2009,5:40-48.

[6] Steiber A,Kerner J,Hoppel C L.Carnitine:A nutritional,biosynthetic,and functional perspective [J].Mol Aspects Med,2004,25:455-473.

[7] Zammit V A,Ramsay R R,Bonomini M,et al.Carnitine,mitochondrial function and therapy [J].Adv Drug Delivery Rev,2009,61:1353-1362.

[8] Bezaire V,Heigenhauser G J F,Spriet L L.Regulation of CPT I activity in intermyofibrillar and subsarcolemmal mitochondria from human and rat skeletal muscle [J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,286:85-91.

[9] Morash A J,Kajimura M,McClelland G B.Intertissue regulation of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I):Mitochondrial membrane properties and gene expression in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].Biochim Biophys Acta,2008,1778:1382-1389.

[10] Morash A J,Kajimura M,McClelland G B.Effect of dietary fatty acid composition on the regulation of carnitine palmitoyltransferase (CPT) I in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].Comp Biochem Physiol B,2009,152:85-93.

[11] Wang J T,Liu Y J,Tian L X.Effect of dietary lipid level on growth performance,lipid deposition,hepatic lipogenesis in juvenile cobia (Rachycentroncanadum) [J].Aquaculture,2005,249:439-447.

[12] Chatzifotis S,Takeuchi T,Seikai T.The effect of dietary carnitine supplementation on growth of red sea bream(Pagrusmajor) fingerlings at two levels of dietary lysine [J].Aquaculture,1996,147:235-248.

[13] Jalali Haji-abadi S M A,Soofiani N M,Sadeghi A A,et al.Effect of supplemental dietary L-carnitine and ractopamine on the performance of juvenile rainbow trout,Oncorhynchusmykiss[J].Aquaculture Research,2010,41:1582-1591.

[14] Ozório R O A.Dietary L-carnitine and energy and lipid metabolism in African catfish (Clariasgariepinus) juveniles [D].Netherlands:Wageningen University,2001.

[15] Nogueira N,Cordeiro N,Canada Paula,et al.Separate and combined effects of cyclic fasting and L-carnitine supplementation in red porgy (PagruspagrusL.1758) [J].Aquaculture Research,2010,41:795-806.

[16] Ozório R O A,Uktoseja J L A,Huisman E A,et al.Changes in fatty acid concentrations in tissues of African catfish (ClariasgariepinusBurchell),as a consequence of dietary carnitine,fat and lysine supplementation [J].British Journal of Nutrition,2001,86:623-636.

[17] Gutieres S,Damon M,Panserat S,et al.Cloning and tissue distribution of a carnitine palmitoyltransferase I gene in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].Comp Biochem Physiol B,2003,135:139-151.

[18] Boukouvala E,Leaver M J,Favre-Krey L,et al.Molecular characterization of a gilthead sea bream(Sparusaurata)muscle tissue cDNA for carnitine palmitoyltransferase 1B(CPT 1B) [J].Comp Biochem Physiol B,2010,157:189-197.

[19] Morash A J,Moine C M R L,McClelland G B.Genome duplication events have led to a diversification in theCPTIgene family in fish [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010,299:579-589.

[20] 田 娟，冷向軍，李小勤,等.肉堿對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、體成分和脂肪代謝酶活性的影響 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2009,33(2)：295-302.

Tian J,Leng X J,Li X Q,et al.Effects of dietary carnitine on growth performance,body composition and lipid metabolism enzymes of grass carp,Ctenopharyngodonidella[J].Journal of Fisheries of China,2009,33(2):295-302.(in Chinese)

[21] 高小強(qiáng),田青杰,石洪玥,等.飼料中添加L-肉堿對(duì)牙鲆幼魚生長(zhǎng)、生化組成及血液指標(biāo)的影響 [J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(1)：39-46.

Gao X Q,Tian Q J,Shi H Y,et al.Effects of dietary L-carnitine on growth performance,body composition and blood parameters of Japanese flounder(Paralichthysolivaceus)juvenile [J].Journal of Guangdong Ocean University,2012,32(1):39-46.(in Chinese)

[22] Yang S D,Liu F G,Liou C H.Effects of dietary L-carnitine,plant proteins and lipid levels on growth performance,body composition,blood traits and muscular carnitine status in juvenile silver perch(Bidyanusbidyanus) [J].Aquaculture,2012,342/343:48-55.