張恩慧，程芳芳，楊安平，程永安，許忠民，馬青山

(1 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100；2 楊凌職業(yè)技術(shù)學院 生物工程系，陜西 楊凌 712100)

甘藍是十字花科中一種重要的蔬菜作物。甘藍小孢子培養(yǎng)是指利用花粉細胞的全能性，在特定的培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)花粉小孢子，促其發(fā)育成單倍體或雙單倍體植株的一種育種技術(shù)。該技術(shù)近年來在國內(nèi)外均有研究報道[1-5]，但小孢子誘導胚產(chǎn)量低和出胚材料基因型范圍窄等諸多問題，嚴重地制約著甘藍單倍體育種的進程。據(jù)研究報道，甘藍小孢子誘導胚產(chǎn)量低受基因型、培養(yǎng)條件、糖濃度、花粉發(fā)育時期等諸多因素的影響[6-11]，但有關(guān)小孢子供體甘藍生長環(huán)境溫度或株齡影響的研究尚未見報道。同時，研究證實，植物的生長溫度是小孢子培養(yǎng)成敗的決定性因素，而且甘藍株齡、栽培環(huán)境在一定程度上影響甘藍花蕾的發(fā)育程度，進而影響到小孢子培養(yǎng)的效率[12-13]。為此，本研究以12個甘藍品種為試材，分析株齡、栽培環(huán)境及溫度對甘藍小孢子誘導出胚的影響，旨在為提高甘藍小孢子胚產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為Q2、Q4、Q5、碧實綠、萬福、綠球66、將軍、QG65、F1-03、翠寶、HP57和HP20等12個甘藍品種，均由西北農(nóng)林科技大學園藝學院甘藍育種和生物技術(shù)研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 不同株齡甘藍植株的栽培 (1)成株栽培。2011-07-10將具有6片真葉的12種供試甘藍苗定植于大田，于12-06將已結(jié)球緊實的植株帶根挖起移植于地窖假植越冬，翌年03-10取出移栽到露地紗網(wǎng)棚或溫室內(nèi)培養(yǎng)至抽薹顯蕾。

(2)半成株栽培。2011-08-25將12種供試甘藍露地播種育苗，09-28定植田間，冬前植株進入包球初期露地越冬，翌年03-20在半成株田上搭建紗網(wǎng)棚或與成株一起移栽到溫室，培養(yǎng)至抽薹顯蕾。

1.2.2 游離小孢子出胚誘導 在已抽薹的甘藍植株上，選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾，游離出小孢子。參照朱守亮等[14]和楊安平等[15]的研究成果，將洗液B5培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量分數(shù)設為14%，小孢子熱激培養(yǎng)和誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基NLN中的蔗糖質(zhì)量分數(shù)設為17%與14%，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，進行游離小孢子的出胚誘導。

1.2.3 不同株齡甘藍上花蕾小孢子出胚的比較 以Q2、Q4和Q5 3個甘藍品種為試材，分別選取露地紗網(wǎng)棚內(nèi)成株和半成株上的4.0～5.8 mm花蕾，倒置顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時期，然后誘導培養(yǎng)小孢子，比較不同株齡甘藍上花蕾發(fā)育同步性和胚產(chǎn)量?；ɡ侔l(fā)育同步性是指相同長度的花蕾中小孢子所處的單核靠邊期的一致性。依據(jù)單核靠邊期小孢子所占比例(A)，將其評判為很差(A≤65%)、較差(65%75%)4個層次。胚產(chǎn)量=胚狀體數(shù)/花蕾數(shù)(下同)。

1.2.4 溫室和露地栽培甘藍花蕾小孢子出胚的比較 越冬后，選取供試12個甘藍品種的成株，分2部分分別栽植于溫室和露地紗網(wǎng)棚；抽薹顯蕾后至花蕾生長到4.0～5.8 mm時選摘，并游離出小孢子誘導培養(yǎng)，比較露地和溫室2種環(huán)境條件下花蕾小孢子的胚產(chǎn)量。

1.2.5 溫度對甘藍小孢子出胚的影響 選用在地窖中通過低溫春化的甘藍品種Q4成株為試材，將其栽植于加溫溫室中，當植株抽薹顯蕾后，在采蕾前2 d的中午，將溫室內(nèi)溫度設定為24，28(CK)，32 ℃，培養(yǎng)植株花蕾生長，于第3天上午10：00選采4.0～5.8 mm花蕾，培養(yǎng)小孢子出胚，比較溫度對甘藍花蕾小孢子胚產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 株齡對甘藍小孢子出胚的影響

由圖1及表1可以看出，供試Q2、Q4和Q5 3個甘藍品種的成株抽薹顯蕾時間較晚，植株生長勢弱，相同長度花蕾的小孢子單核靠邊期同步性較差；適宜花蕾的持續(xù)取樣時間為11～13 d，其小孢子誘導胚產(chǎn)量為7.2～11.6胚/蕾。3個甘藍品種的半成株抽薹顯蕾時間均較早，植株花枝健壯，花蕾飽滿、小孢子發(fā)育同步性很好，適宜花蕾的持續(xù)取樣時間達14～18 d，其小孢子誘導胚產(chǎn)量為16.8～30.3胚/蕾。這些結(jié)果表明，甘藍半成株上的花蕾品質(zhì)優(yōu)于成株花蕾，其花蕾小孢子誘導胚產(chǎn)量比成株高9.6～18.7胚/蕾。經(jīng)方差分析可知，除Q2和Q5成株的小孢子誘導胚產(chǎn)量無顯著差異外，其余處理的胚產(chǎn)量均存在極顯著差異，且半成株的胚產(chǎn)量極顯著高于成株。由此可見，甘藍半成株上花蕾比成株上花蕾更易誘導出胚狀體。

表 1 株齡對甘藍小孢子出胚的影響

2.2 栽培環(huán)境對甘藍小孢子岀胚的影響

由表2可以看出，在露地和溫室2種環(huán)境下生長的12個甘藍品種，除HP20、HP57和翠寶外，其他9個品種的胚產(chǎn)量均表現(xiàn)為溫室栽培高于露地栽培，差值為0.69～15.16胚/蕾，且除碧實綠外，其余8個甘藍品種在溫室與露地的小孢子胚產(chǎn)量均存在極顯著差異。F1-03在溫室中的胚產(chǎn)量為2.37胚/蕾，露地中未見出胚。由此可見，溫室栽培的甘藍更有利于小孢子誘導出胚。

2.3 溫度對甘藍小孢子出胚的影響

小孢子供體植株生長的環(huán)境溫度對小孢子的發(fā)育起著重要作用，溫度過低或過高都會導致小孢子發(fā)育不正常，從而影響小孢子的出胚情況。由圖2及表3可以看出，24或32 ℃處理2 d的甘藍Q4花蕾小孢子發(fā)育同步性差，適宜誘導培養(yǎng)的花蕾長度為5.1～5.6 mm或4.5～4.8 mm；其小孢子誘導的胚產(chǎn)量均較少，分別為11.8和23.2胚/蕾。而28 ℃處理2 d后，Q4品種花蕾小孢子發(fā)育同步性最好，花蕾適宜長度為4.9～5.1 mm，最大值和最小值僅相差0.2 mm；其小孢子誘導出胚數(shù)最多，胚產(chǎn)量高達31.1胚/蕾，顯著高于其他2個處理。由此可見，28 ℃環(huán)境溫度下培養(yǎng)的甘藍花蕾易游離出小孢子，有利于提高胚產(chǎn)量。

表 2 栽培環(huán)境對甘藍小孢子岀胚的影響

圖2 不同環(huán)境溫度下甘藍Q4小孢子誘導出胚的效果

表 3 環(huán)境溫度對甘藍Q4小孢子誘導出胚的影響

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，甘藍成株和半成株均能作為游離小孢子的供體植株，且以半成株花蕾品質(zhì)較好，表現(xiàn)為花蕾小孢子發(fā)育同步性高，胚產(chǎn)量達到16.8～30.3胚/蕾，比成株高9.6～18.7胚/蕾。成株和半成株的胚產(chǎn)量會有如此差異，是因為甘藍植株的生長和發(fā)育狀況會直接影響花蕾中小孢子的生長發(fā)育效果。一般而言，甘藍成株已完全完成營養(yǎng)生長，轉(zhuǎn)入生殖期會因營養(yǎng)期過長導致植株早衰，這可能引起花蕾小孢子發(fā)育同步性差、生長勢弱，并導致其小孢子產(chǎn)胚率低。

本研究發(fā)現(xiàn)，甘藍植株生長在溫室更易獲得小孢子胚，其胚產(chǎn)量比露地栽培增加0.69～15.16 胚/蕾，這與花椰菜[13]的表現(xiàn)一致。這是因為，甘藍抽薹植株生長在相對恒定的栽培環(huán)境條件下，受外界自然因素如溫度、濕度等影響較小，其植株生長健壯、生殖旺盛，花蕾小孢子生長發(fā)育同步性高，有利于小孢子培養(yǎng)，提高胚產(chǎn)量。

綜上所述，甘藍半成株較成株適宜作為游離小孢子培養(yǎng)的花蕾供體；甘藍花蕾供體植株栽培于28 ℃溫室中，花蕾小孢子誘導產(chǎn)生的胚狀體數(shù)多，胚產(chǎn)量高達31.1胚/蕾。

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