伍建榕，汪 洋，趙春燕，陸青華，高 柱，王 芳，馬煥成

(1 國(guó)家林業(yè)局 西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

木棉科(Bombacaceae)植物大多屬喬木或灌木，是優(yōu)良的行道樹樹種。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，木棉具有重要的經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值，對(duì)其的需求量急劇增加。木棉科植物是木本纖維林發(fā)展的優(yōu)先樹種，其果內(nèi)棉毛可作枕、褥、救生圈等的填充料,以其取代化纖，可減少對(duì)石油的依賴，也可為我國(guó)石油能源安全和糧食安全提供支持[1]。木棉還具有耐貧瘠、抗干旱、固土功能強(qiáng)及發(fā)達(dá)的菌根系統(tǒng)等特點(diǎn)，可栽植于立地條件較差的荒山坡地。菌根真菌能在極端干旱條件下與樹木形成共生系統(tǒng),為樹木提供水分和必需的營(yíng)養(yǎng)元素,從而幫助植物抵御干旱[2]。目前，對(duì)草本和灌木的叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizae fungi，AMF)已有報(bào)道[3],但有關(guān)云南干熱河谷區(qū)域內(nèi)高大喬木木棉樹種叢枝菌根真菌的研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)云南干熱河谷地區(qū)木棉科植物根及根際周圍AMF的分布狀況進(jìn)行了調(diào)查，旨在為篩選對(duì)干熱河谷木棉生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用的AMF菌種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)域概況

調(diào)查區(qū)域位于云南省紅河州個(gè)舊市保和鄉(xiāng)冷墩村，為云南攀大木棉科技應(yīng)用有限公司的種植基地，地處102°56′48.09″～102°57′14.01″ E，23°11′19.48″～23°11′59.26″ N，海拔319～425 m，屬典型的干熱河谷氣候。調(diào)查區(qū)域年均氣溫25.12 ℃，極端最高氣溫47.5 ℃，最低氣溫0 ℃；無(wú)霜期363 d；日照時(shí)數(shù)1 770.2 h；年均降雨量低于700 mm，蒸發(fā)量大于降雨量，且雨季和旱季分明，6-9月為雨季，降雨量占全年降雨量的85%以上，2-5月幾乎無(wú)雨，嚴(yán)重干旱。土壤為燥紅土，0～20 cm土層土壤理化性質(zhì)為pH 7.03，有機(jī)質(zhì)14.58 g/kg，堿解氮12.4 mg/kg，速效鉀51.4 mg/kg,速效磷0,非常適宜木棉樹的生長(zhǎng)[4]。

1.2 AMF的分離與鑒定

于2011-01-2012-01，分雨季和旱季在云南干熱河谷地區(qū)的元陽(yáng)、元江、元謀、東川、賓川和怒江6個(gè)區(qū)域，采集野生及人工栽培木棉科樹種根區(qū)須根及須根所帶土壤樣品共54份。取所采集的土壤樣品20 g放入150 mL無(wú)菌蒸餾水中,用磁力棒均勻攪拌10 min或自然浸泡30～40 min，然后用浙江上虞市華豐五金儀器有限公司生產(chǎn)的孔徑為850，425，150，106，75和38 μm的篩進(jìn)行濕篩[5]收集孢子，將孢子及殘留物用自來(lái)水反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在體視鏡(LEICAS6E)下將形態(tài)相近的AMF孢子檢出。將分離檢出的AMF孢子分別放在蒸餾水、乳酸、乳酸甘油和Melzer’s 試劑[6-7]中觀察，記錄孢子的分類特征并拍照。參照Schench等[8]、http://invam.caf.wvu.edu圖譜對(duì)照及近幾年研究成果，對(duì)AMF孢子進(jìn)行鑒定，并于顯微鏡(NikonE800)下測(cè)量孢子形態(tài),鑒定到種[9-10]。標(biāo)本存放在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林病理實(shí)驗(yàn)室。

1.3 菌根侵染率檢測(cè)

菌根侵染率檢測(cè)采用Phillips等[11]的染色方法。將采集的木棉根系用自來(lái)水沖洗后剪成1 cm長(zhǎng)的根段，置于FAA固定液中固定24 h后用自來(lái)水沖洗，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KOH溶液浸透根樣，90 ℃水浴中保溫1 h，用清水洗去KOH，加堿性H2O2(3 mL NH4OH+30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% H2O2+60 mL H2O混勻)軟化根段，室溫下放置20 min，洗去堿性H2O2。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% HCl 3～4 min酸化后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%曲利苯藍(lán)染色液于90 ℃水浴中保溫30 min,使染料快速滲透到根組織和菌根真菌細(xì)胞中。染色后，將根樣放到乳酸甘油中浸泡以除去多余的染料，使菌根的菌絲、泡囊和叢枝保持染色狀態(tài)，然后制片，在顯微鏡下觀察菌絲、泡囊、叢枝的結(jié)構(gòu)特征，確定菌根的結(jié)構(gòu)類型。統(tǒng)計(jì)根段中AMF侵染的根段數(shù)，計(jì)算菌根侵染率和侵染強(qiáng)度[12]。

菌根侵染率=(AMF侵染的根段長(zhǎng)/檢查根段總長(zhǎng))×100%。

侵染強(qiáng)度分為5個(gè)等級(jí)[13]：1級(jí)，受侵染的營(yíng)養(yǎng)根數(shù)占觀察總根數(shù)的0～5%；2級(jí)，受侵染的營(yíng)養(yǎng)根數(shù)占觀察總根數(shù)的6%～25%；3級(jí)，受侵染的營(yíng)養(yǎng)根數(shù)占觀察總根數(shù)的26%～50%；4級(jí)，受侵染的營(yíng)養(yǎng)根數(shù)占觀察總根數(shù)的51%～75%；5級(jí)，受侵染的營(yíng)養(yǎng)根數(shù)占觀察總根數(shù)的76%～100%。

1.4 AMF孢子密度的測(cè)定

從帶根土樣中取100 g風(fēng)干土2份，1份在105 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定土壤含水量；另1份用濕篩傾析法[13]分離孢子于培養(yǎng)皿內(nèi)，在解剖鏡下分格計(jì)數(shù)(孢子果按1個(gè)孢子計(jì)數(shù))，按下列公式計(jì)算孢子密度[14]，各土樣均重復(fù)3次。

土壤含水量=(土壤濕質(zhì)量-土壤干質(zhì)量)/土壤濕質(zhì)量×100%。

孢子密度=孢子總數(shù)/[土壤濕質(zhì)量×(1-土壤含水量)]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南干熱河谷地區(qū)木棉AMF的種類及鑒定

從云南干熱河谷地區(qū)所采集的54份樣品中，共分離出3屬6種AMF,分別為幼套球囊霉Claroideoglomusetunicatum(W.N. Becker & Gerd.) C.Walker & A.Schüβler、摩西球囊霉Funneliformismosseae(T.H.Nicolson & Gerd.) C.Walker & A.Schüβler、何氏球囊霉GlomushoiBerch & Trappe、縮球囊霉Funneliformisconstrictum(Trappe) C.Walker & A.Schüβler 、蘇格蘭球囊霉Glomuscaledonium(Nicol.& Gerd)Trappe & Gerd和細(xì)凹無(wú)梗囊霉AcaulosporascrobiculataTrappe，其形態(tài)見圖1。6種AMF中，幼套球囊霉和摩西球囊霉較其他種類出現(xiàn)頻率更高，孢子數(shù)量較多,初步認(rèn)為這2種是云南干熱河谷地區(qū)木棉科植物AMF的優(yōu)勢(shì)種。

2.1.1 幼套球囊霉 厚垣孢子土壤中單生，黃色或棕黃色，圓形或近圓形，直徑90～155 μm。孢壁2層，外層無(wú)色透明，厚2～5 μm；內(nèi)層黃色或黃棕色，厚4～6 μm。未成熟的厚垣孢子有外壁完整的外套，成熟后易脫落,連孢菌絲大部分脫落，但?？梢姎埩粑锎嬖赱15]。

2.1.2 摩西球囊霉 厚垣孢子土壤中單生，或在根和孢子果內(nèi)，淡黃或淡黃棕色，圓形至近圓形，直徑130～160 μm。孢壁2層，外層無(wú)色透明，厚0.5～1 μm，成熟后常脫落；內(nèi)壁淡黃或淺黃棕色，厚1.5～2.0 μm；孢壁在連點(diǎn)處增厚至6 μm左右，連點(diǎn)漏斗狀，寬15～25 μm，漏斗底部有厚凹隔[16]。

2.1.3 何氏球囊霉 厚垣孢子土壤中單生，孢子淡黃棕色，圓形至近圓形，直徑90～110 μm。孢壁2層，外層淺黃棕色，厚3～4 μm；內(nèi)層無(wú)色透明，厚≤1 μm；孢子破裂后有皺折，連點(diǎn)直或小喇叭形[11]，寬11～15 μm，連孢菌絲寬為9～11 μm，壁厚2～3 μm[14]，在Melzer’s試劑中孢子呈桔黃色。

2.1.4 縮球囊霉 厚垣孢子土壤中單生，深黃棕色至深紅棕色或黑色，光滑發(fā)亮，圓形、近圓或長(zhǎng)圓形，直徑120～190 μm。孢壁1 層，厚5～7 μm；連點(diǎn)縊縮明顯，寬11～13 μm，連點(diǎn)處由孢壁封閉，或不封閉，僅留一狹小孔道[17]，連孢菌絲在連點(diǎn)下方膨大至17～23 μm，淡至黃棕色，并常向孢子一側(cè)彎曲，連點(diǎn)后菌絲變細(xì)至7～11 μm，菌絲有一分隔，隔下菌絲常雙叉分枝，無(wú)色或淡黃色。

2.1.5 蘇格蘭球囊霉 厚垣孢子土壤中單生，孢子淡黃色,圓形至近圓形,直徑120～250 μm。孢壁2層，外層無(wú)色透明,厚1～2 μm，外壁在連點(diǎn)處略增厚,易和內(nèi)壁分離；內(nèi)壁淡黃色,厚2～8 μm,連點(diǎn)寬10～35 μm,直或小喇叭形,外壁伸入連孢菌絲一段距離,連點(diǎn)處有一薄隔[18],連孢菌絲寬9～12 μm,色淺。

2.1.6 細(xì)凹無(wú)梗囊霉 厚坦孢子在土壤中單生，孢子側(cè)生在漏斗狀的連孢菌絲上，菌絲近端有一大小與孢子相仿的產(chǎn)孢子囊，孢子完全成熟后產(chǎn)孢子囊即萎縮變空。孢子圓形至近圓形，幼時(shí)無(wú)色、透明，成熟后淡黃至黃褐色，直徑110～150 μm。孢壁4層，外壁淡黃、黃褐色，厚5～6 μm，表面有凹坑形紋飾，凹坑形態(tài)為圓形、長(zhǎng)形、多角狀，或幾個(gè)相連成不規(guī)則的彎曲形，面積(1～5) μm×(1～3) μm，凹深1～2 μm，凹坑有時(shí)密集，有時(shí)稀疏，但大部分情況下布滿孢子表面；內(nèi)壁為3層，無(wú)色透明膜狀壁，厚<1 μm；第3層有時(shí)有粗糙不平的麻點(diǎn)；第4層易與外面的壁分離[17]，在Melzer’s試劑中染成深紅色。

圖1 云南干熱河谷地區(qū)木棉叢枝菌根真菌形態(tài)鑒定

2.2 AMF在木棉根中的侵染率及孢子密度分布特征

在云南干熱河谷地區(qū)采集的木棉科植物的叢枝菌根中，通過(guò)染色可觀察到根內(nèi)的菌絲、泡囊及叢枝(圖2)。對(duì)云南干熱河谷不同地區(qū)、不同季節(jié)及野生和人工種植區(qū)木棉AMF的侵染率、孢子密度和侵染強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)查，并在元陽(yáng)縣6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)6種植被類型中進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表1～4。

圖2 木棉AMF外觀形態(tài)及在木棉根部的菌絲和孢子

由表1～4可見，在調(diào)查的云南干熱河谷的元陽(yáng)、元江、東川、元謀、賓川和怒江6個(gè)地區(qū)中，野生木棉科植物的AMF均為6種，菌根侵染率分別為76.8%～80.7%,60.7%～60.5%,86.8%～80.7%,76.8%～80.7%,66.8%～80.7%和 87.5%～88.9%；孢子密度分別為198.4,98.5,109.6,98.9,148.9和143.4個(gè)/g。在所調(diào)查的野生木棉根中，均被6種AMF所侵染，菌根侵染率達(dá)到76.8%～80.7%，孢子密度達(dá)到198.4個(gè)/g；而人工種植的木棉根中，僅被5種AMF所侵染，菌根侵染率為50.7%～60.5%，孢子密度為98.5個(gè)/g。雨季的厚垣孢子數(shù)量較多，為188.4個(gè)/g；旱季較少，為90.5個(gè)/g。香蕉林植被的木棉菌根侵染率最高，可達(dá)到90.3%～90.7%，孢子密度達(dá)156.4 個(gè)/g；河谷邊的木棉菌根侵染率最低，僅為 62.8%～60.3%，孢子密度為89.3個(gè)/g。

表 1 云南干熱河谷 6個(gè)區(qū)域木棉AMF孢子密度、侵染率及侵染強(qiáng)度的比較

表 2 云南干熱河谷地區(qū)元陽(yáng)野生和人工木棉種植區(qū)AMF孢子密度、侵染率及侵染強(qiáng)度的比較

表 3 不同季節(jié)野生木棉AMF孢子密度、侵染率及侵染強(qiáng)度的比較

表 4 元陽(yáng)縣6個(gè)木棉自然生長(zhǎng)點(diǎn)不同植被類型AMF孢子密度、侵染率及侵染強(qiáng)度的比較

3 結(jié)論與討論

AMF具有豐富的物種多樣性[18]和遺傳多樣性。Sykorová等[19]證實(shí),AMF群落組成受到寄主植物種類的影響, 生長(zhǎng)習(xí)性不同或起源、遺傳背景復(fù)雜的一些多年生木本植物會(huì)影響叢枝菌根真菌的多樣性[20]。本試驗(yàn)從云南干熱河谷的6個(gè)典型地區(qū)的野生及人工栽培木棉科樹種須根及其所帶土壤中，分離鑒定出3屬6種AMF，其中，幼套球囊霉和摩西球囊霉較其他種類出現(xiàn)頻率高,孢子數(shù)量多，初步認(rèn)為這2種是云南干熱河谷地區(qū)木棉叢枝菌根真菌的優(yōu)勢(shì)種。本研究還發(fā)現(xiàn)，AMF的分布在不同季節(jié)也不相同，土壤干旱會(huì)降低AMF的產(chǎn)孢能力和侵染活性，雨季的厚垣孢子數(shù)量較多，旱季較少；不同的植被類型也影響AMF厚垣孢子的數(shù)量，植被類型多的林地孢子數(shù)量比土壤植被類型少的林地(相對(duì)貧瘠的)少。值得重視的是, 本研究發(fā)現(xiàn)土壤水分含量(旱季和雨季)與AMF對(duì)樹木根的侵染率密切相關(guān)，這與李晉等[7]的研究結(jié)果一致。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 高 柱,王小玲,汪 洋,等.木棉栽培技術(shù)研究進(jìn)展 [J].江西科學(xué),2009,27(5):761-766.

Gao Z,Wang X L,Wang Y,et al.Study advances on cultivation techniques in Kapok tree [J].Jiangxi Science,2009,27(5):761-766.(in Chinese)

[2] Schenck N C,Perez Y.Manual for identification of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi [M].2nd ed.Florida,USA:University of Florida INVAM Gaineville,1988:79-94.

[3] Corcuera L,Camarero J J,Gil-Pelegrin E.Effects of a severe drought onQuercusilexradialgrowth and xylem anatomy [J].Trees,2004,18:83-92.

[4] 高 柱.木棉產(chǎn)業(yè)化栽培關(guān)鍵技術(shù)初探 [D].昆明:西南林業(yè)大學(xué),2012.

Gao Z.Key cultivation techniques of Bombacaceae plant industrialization [D].Kunming:Southwest Forestry University,2012.(in Chinese)

[5] 劉潤(rùn)進(jìn),焦 惠,李 巖,等 叢枝菌根真菌物種多樣性研究進(jìn)展 [J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2009,20(9):2301-2307.

Liu R J,Jiao H,Li Y,et al.Research advances in species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi Chinese [J].Journal of Applied Ecology,2009,20(9):2301-2307.(in Chinese)

[6] Li T，Li J P，Zhao Z W.Arbuscular mycorrhizas in a valley-type savanna in southwest China [J].Mycorrhiza,2004,14:323-327.

[7] 李 晉，景躍波，張勁峰,等.香格里拉亞高山兩種植被類型主要植物的叢枝菌根研究 [J].西部林業(yè)科學(xué),2012,41(2):43-50.

Li J，Jing Y B，Zhang J F,et al.Arbuscular mycorrhiza across two vegetation types in Shangri-la Subalpine areas of Northwest [J].Journal of West China Forestry Science,2012,41(2):43-50.(in Chinese)

[8] Schench N C,Yvonne Perez.Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi [M].Florida:INVAM Gainesville,1988:119-197.

[9] 石兆勇,陳應(yīng)龍,劉潤(rùn)進(jìn).尖峰嶺地區(qū)龍腦香科植物根圍的AM真菌 [J].菌物系統(tǒng),2003,22(2)：211-215.

Shi Z Y,Chen Y L,Liu R J.Arbuscular mycorrhizal fungi of Dipterocarpaceae in Jianfengling Mountain,Hainan Province [J].Mycosystema,2003,22(2)：211-215.(in Chinese)

[10] An Z Q,Hendrix J W,Hershman D E,et al.Evaluation of the “most probable number” (MPN) and wet-sieving methods for determining soil-borne populations of endogonaceous mycorrhizal fungi [J].Mycologia,1990,82:516-581.

[11] Phillips J M，Hayman D S.Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection [J].Transactions of the British Mycological Society,1970,55(1):158-161.

[12] 李曉林，馮 固.叢枝菌根生態(tài)生理 [M].北京：華文出版社，2001:13-19.

Li X L,Feng G.Eology and physiology of arbuscular mycorrhizae [M].Beijing:Huawen Press,2001:13-19.(in Chinese)

[13] Nicolson T H,Schenck N C.Endogonaceous mycorrhizal endophytes in Florida [J].Mycologia,1979,71:178-198.

[14] 唐 明.菌根真菌提高植物耐鹽性 [M].北京:科學(xué)出版社,2010:23-28.

Tang M.Improvement on salt tolerance of plants by mycorrhizal fungi [M].Beijing:Science Press,2010:23-28.(in Chinese)

[15] 肖艷萍,李 濤,費(fèi)洪運(yùn),等.云南金頂鉛鋅礦區(qū)叢枝菌根真菌多樣性的研究 [J].菌物學(xué)報(bào),2008,27(5):652-662.

Xiao Y P,Li T,Fei H Y,et al.Species diversity of arbuscular mycorrizal fungi in Jinding Pb-Zn mining area of Lanping, Yunnan [J].Mycosystema,2008,27(5):652-662.(in Chinese)

[16] Li T,Li L F,Sha T,et al.Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi associated with two dominant xerophytes in a valley-type savanna,southwest China [J].Applied Soil Ecology,2010(44):61-66.

[17] 劉潤(rùn)進(jìn),李曉林.叢枝菌根及其應(yīng)用 [M].北京:科學(xué)出版社,2000:9.

Liu R J,Li X L.Arbuscular mycorrhiza and its application [M].Beijing:Science Press,2000:9.(in Chinese)

[18] 郭秀珍,畢國(guó)昌.林木菌根及應(yīng)用技術(shù) [M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1989:119.

Guo X Z, Bi G C.Forest tree mycorrhiza and application technology [M].Beijing:China Forestry Publishing Press,1989:119.(in Chinese)

[19] Sykorová Z,Wiemken A,Redecker D.Co-occurringGentianavernaandGentianaacaulisand their neighboring plants in two swiss upper montane meadows harbor distinct arbuscular mycorrhizal fungal communities [J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73：5426-5434.

[20] Daniels B A,Skiper H D.Methods and principles of mycorrhizal research [M].St.Paul,USA:American Phytopathology Society，1982:29-35.