喬亞紅，田桂英，鄭銀英，崔百明，李詩(shī)林，向本春

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

病毒病是加工番茄生產(chǎn)中的主要病害之一。近年來，隨著加工番茄的大面積種植和連續(xù)種植，連作和重茬增多，病毒病害也日趨嚴(yán)重。黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)是嚴(yán)重危害加工番茄的2種主要病毒[1-2]。其中,CMV屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)，是目前世界范圍內(nèi)危害蔬菜最嚴(yán)重的病毒之一。ToMV是與煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)關(guān)系最近的一種病毒，屬于煙草花葉病毒屬，其寄主范圍廣,能侵染茄科、禾本科、十字花科、豆科等許多植物。在實(shí)際生產(chǎn)中，這2種病毒往往是復(fù)合侵染加工番茄，使加工番茄枝條上出現(xiàn)嚴(yán)重的條斑壞死癥狀，果實(shí)表面則生成褐色斑塊，僵小畸形，嚴(yán)重影響了加工番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。

RNAi 是生物體本身的一種RNA防御機(jī)制，普遍存在于植物、動(dòng)物和真菌等大多數(shù)真核生物中[7-9]。植物體天然的 RNAi 系統(tǒng)不能完全抵御某種病毒的入侵，如果人為地將該病毒的某一段序列設(shè)計(jì)成含反向重復(fù)的結(jié)構(gòu)雙鏈，轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，使其在植物體內(nèi)表達(dá)從而誘發(fā)RNAi 產(chǎn)生 dsRNA，可有效地強(qiáng)化植物體自身的 RNAi 抗病毒機(jī)制，獲得較高抗性的轉(zhuǎn)基因植物，達(dá)到延遲和減輕病毒病害的目的。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物抗病毒方面的研究，并取得了很好的效果[10-12]。Waterhouse等[13]針對(duì)馬鈴薯 Y 病毒(PVY)蛋白酶基因片段構(gòu)建 IRS 載體，用其轉(zhuǎn)化煙草獲得了抗性植株。Wang等[14]用大麥黃矮病毒(BYDV-PAV)多聚酶基因的反向重復(fù)序列載體轉(zhuǎn)化大麥，獲得了對(duì)BYDV免疫級(jí)抗性的轉(zhuǎn)基因大麥植株。朱俊華等[15]將 PVYCP部分序列的反向重復(fù)序列載體轉(zhuǎn)化煙草, 獲得了對(duì)PVY免疫的轉(zhuǎn)基因植株。顏培強(qiáng)等[16]利用 TMVCP和 CMVCP部分序列的融合基因片段構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得了抗TMV、CMV的轉(zhuǎn)基因煙草植株。但實(shí)際生產(chǎn)中，往往是多種病毒復(fù)合侵染同一寄主植物，利用RNAi技術(shù)，可以將多個(gè)病毒部分基因序列進(jìn)行融合，構(gòu)建抗多種病毒的載體，轉(zhuǎn)化植株后即可獲得具有抗多種病毒能力的植株。

本研究利用 RNAi 技術(shù)，分別選取新疆加工番茄 CMV 分離物 NS0-4 和 ToMV 分離物SCS-2，以二者的復(fù)制酶部分序列作為干擾片段，通過 T 克隆載體拼接，構(gòu)建含反向重復(fù)結(jié)構(gòu)拼接片段的 RNAi 表達(dá)載體 pBi35STC12， 以期獲得抗這 2 種病毒的轉(zhuǎn)基因加工番茄，為加工番茄病毒病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 毒源、植物、菌株及載體 供試毒源為黃瓜花葉病毒(CMV)分離物 NS0-4 和番茄花葉病毒(ToMV)分離物 SCS-2，均為石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。供試植物為加工番茄紅番3號(hào)種子，為市售。菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，均為石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。載體為中間載體 piRDG12 和表達(dá)載體 pBi35SDG12，均為石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AMV)、pGEM-T easy、T4DNA連接酶、Plant Genomic DNA Kit 植物基因組 DNA 提取試劑盒、Wizard DNA clean-up kit 凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自 Promega公司；TaqDNA 聚合酶和RNA prep pure plant kit，均購(gòu)自TIANGEN 公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 Fermentas 公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 1/2MS 液體培養(yǎng)基：1/2MS 大量元素+MS 微量元素+MS 鐵鹽+MS 有機(jī)物質(zhì)+15 g/L 蔗糖，pH 5.8；分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L+植物凝膠 2 g/L，pH 5.8；共培養(yǎng)基：MS+6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L+AS(乙酰丁香酮)100 μmol/L+植物凝膠 2 g/L，pH 5.8；篩選培養(yǎng)基：MS+ZT 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+Carb(羧芐青霉素) 300 mg/L+Kan(卡那霉素) 50 mg/L+植物凝膠2 g/L，pH 5.8；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+IAA 0.1 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L+植物凝膠2 g/L，pH 5.8。

1.2 RNAi 載體的構(gòu)建

1.2.1 毒源活化和總RNA提取 通過機(jī)械摩擦的方法，用NS0-4接種西方煙(Nicotianaoccidentalis)，SCS-2接種心葉煙(Nicotianaglutinosa)。 NS0-4 在接種約 20 d 后出現(xiàn)癥狀，提取西方煙總 RNA1；SCS-2在接種第 3天出現(xiàn)癥狀后，提取心葉煙總 RNA2。具體操作方法依照 RNA prep pure plant kit說明書進(jìn)行。

1.2.2 干擾片段的選擇 根據(jù) NS0-4 和 SCS-2 基因全序列，利用 Vector NTI 軟件進(jìn)行分析，選取NS0-4 1a復(fù)制酶第 1 051-1 350 bp 序列(300 bp)和 SCS-2 130/180 ku復(fù)制酶第 1 920-2 200 bp 序列(281 bp)的cDNA 作為干擾片段。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)干擾片段和pBi35SDG12載體Intron序列兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物,CR12SP：5′-CGGGATCCTGCCCACCCGAACTCATTCGA-3′(BamHⅠ)，CR12ASP：5′-GGGGTACCGCAATATAATGATAATCGTT-AATATCGATGCGTT-3′(KpnⅠ)；To12SP：5′-CGAGCTCGGATCCTGTTGCGCTAGCATTGC-AAGATTCT-3′(SacⅠ+BamHⅠ)，To12ASP：5′-GAAGATCTTAAAGTTTTTCATTTGTTGAA-CTTTAAGAGGGC-3′(BglⅡ)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)之前的堿基為保護(hù)堿基。

1.2.4 干擾片段的RT-PCR擴(kuò)增 將總RNA1(NS0-4)和總RNA2(SCS-2)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AMV)說明書分別合成cDNA1 和cDNA2 。以cDNA1為模板，用引物CR12SP和CR12ASP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1a復(fù)制酶第1 051-1 350 bp 316 bp大小的片段CR12；以cDNA2為模板，用引物To12SP和To12ASP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到130/180 ku復(fù)制酶第1 920-2 200 bp約302 bp大小的片段To12。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)后，將CR12和To12分別克隆到pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coilDH5α，酶切鑒定正確后，重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將構(gòu)建的載體命名為pGEM-T-CR12和pGEM-T-To12。

1.2.5 干擾片段的拼接 將 pGEM-T-CR12 用BamHⅠ/PstⅠ酶切回收含 CR12 的小片段，pGEM-T-To12 用BglⅡ/PstⅠ酶切回收含 To12 的大片段，然后將回收的大小片段通過同位酶(BamHⅠ/BglⅡ)連接得到pGEM-T-TC12。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coilDH5α，酶切鑒定正確后，重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。干擾片段的拼接流程見圖1。

1.2.6 中間載體的構(gòu)建 用BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切 pGEM-T-TC12 質(zhì)粒及piRDG12 載體質(zhì)粒，回收含 CR12-To12 的正向片段和 piRDG12 載體的相應(yīng)片段，將它們連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coilDH5α，酶切鑒定正確后，將構(gòu)建的載體命名為 piRTC12_R。用SpeⅠ/SacⅠ雙酶切 pGEM-T-TC12 質(zhì)粒及 piRTC12_R 質(zhì)粒，回收含CR12-To12 的反向片段和 piRTC12_R 的相應(yīng)片段，將它們連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coilDH5α，酶切鑒定正確后，將構(gòu)建的載體命名為 piRTC12。

1.2.7 RNAi載體的構(gòu)建 用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切中間載體 piRTC12 及植物表達(dá)載體pBi35SDG12，回收目的片段，連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coilDH5α 中，酶切鑒定正確后，將構(gòu)建正確的 RNAi 載體命名為 pBi35STC12。RNAi 載體的構(gòu)建見圖2。

1.3 加工番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

將含有 pBi35STC12 質(zhì)粒 DNA 的農(nóng)桿菌 GV3101，在200 r/min、28 ℃ 振蕩培養(yǎng) 1 d，然后將該菌液以 1∶10 比例擴(kuò)大，在200 r/min、28 ℃ 振蕩培養(yǎng) 6 h后于4 ℃ 、5 000 r/min離心15 min，回收菌體，用 1/2MS 液體培養(yǎng)基稀釋到OD600為 0.6～0.8。切取發(fā)芽8～10 d的加工番茄幼苗子葉，置于分化培養(yǎng)基上，于 24 ℃ 黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d后，將子葉置于含菌體的1/2MS 液體培養(yǎng)基中侵染 20 min，撈出后用無菌濾紙吸去多余的農(nóng)桿菌液，置于共培養(yǎng)基中共培養(yǎng) 2 d 后移至含 300 mg/L Carb(羧芐青霉素)和 50 mg/L Kan(卡那霉素)的篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行抑菌﹑篩選培養(yǎng)，之后約 2 周左右換 1 次培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng) 1 次，直至葉緣產(chǎn)生再生芽；當(dāng)不定芽長(zhǎng)到1.5～2 cm 時(shí)，從基部切下，插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。待植株長(zhǎng)到 6～8 cm 時(shí)進(jìn)行馴化培養(yǎng)，1 周后移栽到盆中。

圖1 CMV和ToMV RNA干擾片段的拼接

1.4 轉(zhuǎn)基因加工番茄植株的 PCR 檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因加工番茄植株葉片，用方宣鈞等[17]的方法提取基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 分析。根據(jù)拼接的干擾片段序列，采用Primer 軟件，設(shè)計(jì)檢測(cè)干擾片段正向序列的特異性引物，TC12SP：5′-CGGATCCTGTTGCGCTAGCATTGCAAGATTCT-3′ (BamHⅠ)和 TC12ASP： 5′-GCAATATAATGATAATCGTTAATATCGATGCGTT-3′(下劃線部分為酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)之前的堿基為保護(hù)堿基)，產(chǎn)物大小為 608 bp。PCR 產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)。

根據(jù)pBi35STC12載體的Intron序列和NOS終止子序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)干擾片段反向序列的特異性引物，SP/In-Nos：ACCCTAAATTTATCAAGACAAGGTT和ASP/In-Nos：AAGACCGGCAACAGGATTC，產(chǎn)物大小為762 bp。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMV和ToMV RNA干擾片段的 RT-PCR 擴(kuò)增

以 cDNA1 為模板、CR12SP 和 CR12ASP 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到1條與預(yù)期大小一致的約316 bp 的片段 CR12；以 cDNA2 為模板、To12SP 和 To12ASP 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到1條與預(yù)期大小一致的約302 bp 的片段 To12 (圖3)。將 CR12 和 To12 分別與 pGEM-T easy 連接，得到 pGEM-T-CR12 和 pGEM-T-To12，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，所得序列正確。

2.2 RNAi 載體 pBi35STC12 的構(gòu)建及鑒定

2.2.1 干擾片段的拼接 將質(zhì)粒 pGEM-T-CR12 用BamHⅠ/PstⅠ酶切回收，得到含 CR12 的長(zhǎng)約340 bp 的小片段；將 pGEM-T-To12 質(zhì)粒用BglⅡ/PstⅠ酶切回收，得到含 To12 的長(zhǎng)約 3 280 bp 的大片段(圖4)。通過同位酶(BamHⅠ/BglⅡ)將回收的片段連接，得到pGEM-T-TC12，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，所得序列正確(圖5)。

圖2 CMV 和ToMV RNAi 載體的構(gòu)建

圖3 CMV和ToMV RNA干擾片段的RT-PCR擴(kuò)增

2.2.2 中間載體 piRTC12 的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒 pGEM-T-TC12 用BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定正確，回收含 CR12-To12 的長(zhǎng) 597 bp 的正向片段； 用SpeⅠ/SacⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-TC12 后，回收到含 CR12-To12 的長(zhǎng) 597 bp 的反向片段(圖5)。將回收的正向和反向片段連接到載體 piRDG12 的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，獲得中間載體 piRTC12。經(jīng)XbaⅠ/EcoR Ⅰ 雙酶切鑒定正確(圖6)。

2.2.3 pBi35STC12的構(gòu)建及鑒定 將鑒定正確的中間載體 piRTC12，用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收到長(zhǎng) 1 752 bp 的目的片段(圖6)，連接到表達(dá)載體 pBi35SDG12 的相應(yīng)位點(diǎn)，得到植物表達(dá)載體 pBi35STC12，對(duì)其進(jìn)行XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，獲得長(zhǎng)1 752 bp 和 9 571 bp 的片段(圖7)。

圖4 pGEM-T-CR12和pGEM-T-To12干擾片段的融合酶切

圖6 中間載體 piRTC12的酶切鑒定

2.3 轉(zhuǎn)基因加工番茄植株的獲得

以紅番 3 號(hào)加工番茄為轉(zhuǎn)化受體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì) 1 500 個(gè)外植體進(jìn)行侵染、轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出愈傷組織、分化出綠芽，待小芽長(zhǎng)到 1.5～2 cm 后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。待植株長(zhǎng)到 6～8 cm 時(shí)進(jìn)行煉苗，然后再移入盆中，共移栽 33 株，成活了 33 株(圖8)。

圖8 轉(zhuǎn)基因加工番茄植株的獲得

2.4 轉(zhuǎn)基因加工番茄植株的PCR檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)基因加工番茄植株葉片總DNA，分別以 TC12SP、TC12ASP 和 SP/In-Nos、ASP/In-Nos 為引物，通過 PCR 檢測(cè)干擾片段是否成功導(dǎo)入。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，33 株加工番茄轉(zhuǎn)基因再生植株中有19 株均含正向(圖9)和反向干擾片段(圖10)，表明干擾片段已經(jīng)成功整合到加工番茄的基因組中，轉(zhuǎn)化率為 1.26%。

圖9 部分轉(zhuǎn)基因加工番茄植株正向干擾片段的PCR鑒定

圖10 部分轉(zhuǎn)基因加工番茄植株反向干擾片段的PCR鑒定

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著 RNAi 技術(shù)的快速發(fā)展及其工作機(jī)理的不斷闡明,其在植物基因工程研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。但在研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi 植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)、靶基因序列長(zhǎng)度及其在靶基因中的位置,都對(duì) RNAi 的效率和效果產(chǎn)生影響[18]。Wesley等[19]對(duì)幾種不同的 RNAi 載體構(gòu)建獲得的抑制基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果顯示，含有2個(gè)反向重復(fù)序列且中間夾1個(gè)內(nèi)含子所形成的發(fā)夾 hpRNA 結(jié)構(gòu)，能顯著提高 RNA 沉默效果,且沉默效率平均高達(dá) 90% 以上。本研究在2個(gè)反向重復(fù)序列中間有一段大小約266 bp的 Intron 片段，這種結(jié)構(gòu)保證了干擾片段可以按照完全相反的方向插入到目的載體，并在轉(zhuǎn)化后形成發(fā)夾 RNA 結(jié)構(gòu)(hpRNA)。在 RNAi 載體設(shè)計(jì)中，有關(guān)干擾序列長(zhǎng)度以及靶標(biāo)基因片段選擇的位置尚存在爭(zhēng)議，還有待于進(jìn)一步深入研究。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法已被廣泛地應(yīng)用于煙草﹑棉花﹑番茄等作物上，其轉(zhuǎn)化效果受外植體大小、外植體取材部位及培養(yǎng)基中凝膠種類和培養(yǎng)皿封口膜材料等的影響[20]，且轉(zhuǎn)化效率不高，僅為 1.4%～34%[21-23]。本研究中加工番茄遺傳轉(zhuǎn)化率僅為 1.26% ，比已報(bào)道的轉(zhuǎn)化率低，這可能與試驗(yàn)中所選取材料的苗齡、外植體的種類和大小、接種方式、不同作物和品種及其基因型有關(guān)[24-25]。

本研究成功將含 CMV 和 ToMV 分離物復(fù)制酶部分基因的 RNAi 載體 pBi35STC12 轉(zhuǎn)入到加工番茄紅番 3 號(hào)，經(jīng)過 PCR 檢測(cè)獲得了19 株轉(zhuǎn)基因加工番茄植株，通過對(duì) CMV 和 ToMV復(fù)制酶表達(dá)的干擾，影響這 2 種病毒的復(fù)制，從而達(dá)到抗這2種病毒的效果。至于其干擾效果還有待于進(jìn)一步的檢測(cè)驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 馮蘭香,蔡少華,鄭貴彬,等.我國(guó)番茄病毒病的主要毒源種類和番茄上煙草花葉病毒株系的鑒定 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1987,20(3):60-66.

Feng L X,Cai S H,Zheng G B,et al.Identification of main causal viruses of tomato virus diseases and the TMV strains of tomato in China [J].Scientia Agricultura Sinica,1987,20(3):60-66.(in Chinese)

[2] 馮蘭香,田如燕,楊翠榮,等.中國(guó)北方番茄主要病毒種類普查及TMV、CMV株系鑒定 [J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),1996,23(1):52-55.

Feng L X,Tian R Y,Yang C R,et al.A study and identification on tomato virus and TMV,CMV strains in Northern China [J].Journal of Plant Protection,1996,23(1):52-55.(in Chinese)

[3] 姜玉霞,向本春,安仙麗,等.新疆加工番茄上番茄花葉病毒的分子鑒定 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,45(3):484-489.

Jiang Y X,Xiang B C,An X L,et al.Identification on molecular of tomato mosaic virus of processing tomato in Xinjiang [J].Xinjiang Agricultural Sciences,2008,45(3):484-489.(in Chinese)

[4] 常 波,向本春,劉升學(xué),等.新疆加工番茄條斑壞死病原黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因的克隆和序列分析 [J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,24(4):410-414.

Chang B,Xiang B C,Liu S X,et al.Cloning and sequence analysis of coat protein gene of cucumber mosaic virus isolate from stripe and necrosis virus of processing tomatoes in Xinjiang [J].Journal of Shihezi University:Natural Science,2006,24(4):410-414.(in Chinese)

[5] 趙祥樹，向本春，劉升學(xué)，等.新疆天山北部地區(qū)加工番茄上ToMV和CMV的動(dòng)態(tài)分析 [J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,28(5):561-564.

Zhao X S,Xiang B C,Liu S X,et al.Population dynamics ofTomatomosaicvirusandCucumbermosaicvirusof processing tomato in the north of Tianshan mountains in Xinjiang [J].Journal of Shihezi University:Natural Science,2010,28(5):561-564.(in Chinese)

[6] 許文博，都業(yè)娟，黃家風(fēng).加工番茄CMV與ToMV的ELISA檢測(cè)及其相關(guān)性分析 [J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,27(2):199-201.

Xu W B,Du Y J,Huang J F.Virus detection by ELISA and correlation analysis between ToMV and CMV [J].Journal of Shihezi University:Natural Science,2009,27(2):199-201.(in Chinese)

[7] Waterhouse P M,Graham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and anti-sense RNA [J].BMC Plant Biology,1998,95(23):13959-13964.

[8] Wianny F,Zernicka-Goetz M.Specific interference with gene fu-nction by double-stranded RNA in early mouse development [J].Nature Cell Biology,2000,2(2):70-75.

[9] Cogni C,Macino G.Gene silencing inNeurosporacrassarequires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase [J].Nature,1999,399:166-169.

[10] 朱常香,宋云枝.多抗PVY、TMV和CMV轉(zhuǎn)基因煙草的培育 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(4):1040-1047.

Zhu C X,Song Y Z.Production of transgenic tobacco plants with multi-virus resistance via RNA-mediated virus resistance [J].Scientia Agricultura Sinica,2008,41(4):1040-1047.(in Chinese)

[11] Shuichiro Takahashi,Ken Komatsu,Satoshi Kagiwada,et al.The efficiency of interference of potato virus X infection depends on the target gene [J].Virus Research,2006,11:6214-6217.

[12] 李奇科,陶 剛,邱又彬,等.馬鈴薯Y病毒CP基因RNAi 載體構(gòu)建與干涉效果測(cè)定 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用,2009,28(3):460-464.

Li Q K,Tao G,Qiu Y B,et al.RNAi vector targeting and interference effect determination of PVY CP gene [J].Genomics and Applied Biology,2009,28(3):460-464.(in Chinese)

[13] Waterhouse P M,Garham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA [J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:13959-13964.

[14] Wang M B,Abbott D C,Waterhouse P M.A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus [J].Mol Plant Pathol,2000,1(6):347-356.

[15] 朱俊華,朱常香,溫孚江,等.正向和反向重復(fù)RNA介導(dǎo)的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究 [J].植物病理學(xué)報(bào),2004,34(2):133-140.

Zhu J H,Zhu C X,Wen F J,et al.Comparison of resistance to potato virus Y mediated by direct and inverted repeats of the coat protein gene segments in transgenic tobacco plants [J].Acta Phytopathologica Sinica,2004,34(2):133-140.(in Chinese)

[16] 顏培強(qiáng),李麗杰,康 宏,等.應(yīng)用RNAi技術(shù)培育抗2種病毒病的轉(zhuǎn)基因煙草 [J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(11):27-31.

Yan P Q,Li L J,Kang H,et al.RNA interference mediated inhibition of TMV and CMV virus in tobacco [J].China Biotechnology,2007,27(11):27-31.(in Chinese)

[17] 方宣鈞,孔 巍,金蕪軍.快速一步法(ROSE法)提取DNA應(yīng)用于RAPD-PCR擴(kuò)增 [J].高技術(shù)通訊,1997(10):40-43.

Fang X J,Kong W,Jin W J.Rapid one step DNA extraction for RAPD-PCR amplification [J].High Technology Letters,1997(10):40-43.(in Chinese)

[18] 張 恭,劉立峰,馬峙英.RNA干擾及其植物抗病毒應(yīng)用 [J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(1):42-45.

Zhang G,Liu L F,Ma S Y.RNA interference and its application in plant anti-virus [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2007,23(1):42-45.(in Chinese)

[19] Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants [J].The Plant Journal,2001,27(6):581-590.

[20] Frary A,Earle E D.An examination of factors affecting the efficiency ofAgrobacterium-mediated transformation of tomato [J].Plant Cell Reports,1996,16:235-240.

[21] Carolina Cortina,Francisco A Culi’aez-Maci’a.Tomato tran-sformation and transgenic plant production [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2004,76:269-275.

[22] van Roekel J S C,Damm D,Melchers L S,et al.Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersiconesculentum) [J].Plant Cell Reports,1993,12:644-647.

[23] Pozueta-Romero J,Houlne G,Canas L,et al.Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants forAgrobacterium-mediated transformations [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2001,67:173-180.

[24] 彭細(xì)橋,戴良英,劉紅艷.番茄離體再生體系優(yōu)化研究 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,30(6):506-509.

Peng X Q,Dai L Y,Liu H Y.Study on regenerative system of tomato [J].Journal of Hunan Agricultural University:Natural Sciences,2004,30(6):506-509.(in Chinese)

[25] 于慧敏,石 竹,楊俊杰.番茄的不同基因型對(duì)組培植株再生能力的影響 [J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,22(4):120-130.

Yu H M,Shi Z,Yang J J.Effects different tomato genotypes on the plant regeneration in tissue culture [J].Journal of Shandong Normal University:Natural Science,2007,22(4):120-130.(in Chinese)