張翠葉，辛福梅，楊小林，洛桑曲杰

(1 西藏自治區(qū)林業(yè)調(diào)查規(guī)劃研究院，西藏 拉薩 850000；2 西藏大學 農(nóng)牧學院，西藏 林芝 860000)

體細胞胚胎發(fā)生是指在離體條件下使植物體細胞通過與合子胚類似的發(fā)育途徑形成新個體的過程。相對于器官發(fā)生而言，體細胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點。體細胞胚胎發(fā)生為植物細胞分化、全能性表達提供了理想的試驗體系，在林木人工種子育苗、瀕危植物挽救等方面具有重要意義[1]。櫟屬植物是林木體細胞胚胎發(fā)生的研究熱點之一。目前研究涉及的主要樹種有十余種，研究較多的有歐洲栓皮櫟(Quercussuber)[2-3]、夏櫟(Quercusrobur)[4]、麻櫟(Quercusacutissima)[5-6]、栓皮櫟(Quercusvariabilis)[7]等，已在研究材料、培養(yǎng)技術(shù)等方面取得較大成功。

川滇高山櫟(Quercusaquifolioides)作為西藏東南部、四川西部、云南西北部的特有樹種，主要分布范圍為海拔2 400～3 400 m，喬木高達30 m，但在干旱陽坡或遭受經(jīng)常樵采后則退變成灌木叢林[8]。該樹種適應(yīng)性好，具有較強的抗環(huán)境干擾能力和旺盛的萌蘗能力以及優(yōu)良的水土保持和水源涵養(yǎng)作用，是當?shù)刂匾脑炝謽浞N。同時也具有較高的經(jīng)濟價值，其木材堅硬，樹皮和堅果含單寧，可用于鞣制皮革、護膚、入藥等，亦可作為生物能源和為食用菌生產(chǎn)提供原料。因川滇高山櫟種子易受種實害蟲侵害且不耐儲藏，并且嫁接、扦插困難，目前主要依靠天然更新。前人對川滇高山櫟的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征、生長特點、生物量、種群群落生態(tài)學等方面[9-15]，尚未見有關(guān)其體胚發(fā)生及組織培養(yǎng)方面的報道。為此，本研究以川滇高山櫟未成熟合子胚為材料，研究基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑配比、采樣時期、培養(yǎng)條件、抗氧化劑等因素對川滇高山櫟胚性細胞誘導(dǎo)的影響，以期為川滇高山櫟優(yōu)良無性系繁殖、基因保存、遺傳改良等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

分別于2011-06-10、07-10、08-10、09-10從西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)覺木溝川滇高山櫟天然林的同一林分中采樣，每次固定從胸徑相當、彼此相距30 m左右的10棵樹上，將前一年開花授粉所結(jié)的小堅果連同殼斗一起采下，用塑料袋分裝帶回實驗室，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2 川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 接種前剝?nèi)ゴǖ岣呱綑禋ざ啡〕鐾暾怨?，先用自來水沖洗2～3 h，再用體積分數(shù)70%酒精消毒30 s，接著在1 g/L氯化汞溶液中消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗3～5次。無菌條件下用解剖刀剝?nèi)ス?，取出種子，再剝?nèi)シN皮后，胚根向下將全胚接種于培養(yǎng)基上。

1.2.2 基本培養(yǎng)基的篩選 以MS、1/2MS、B5和WPM為基本培養(yǎng)基，同時添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，以單因素對比試驗篩選確定川滇高山櫟胚性愈傷組織形成的最適基本培養(yǎng)基。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配比的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)單獨添加0，1，2，4 mg/L 6-BA和0，0.5，1.0 mg/L 2,4-D的處理以及二者按上述質(zhì)量濃度兩兩配比的處理,觀察川滇高山櫟胚性愈傷組織的生長情況，以確定其最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比。

1.2.4 采樣時期的篩選 將2011-06-10、07-10、08-10、09-10采集的來自于同一母樹的川滇高山櫟未成熟合子胚，接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)觀察，以確定其最佳采樣時期。

1.2.5 培養(yǎng)條件的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，同時添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，接種川滇高山櫟未成熟合子胚進行光暗培養(yǎng)條件的篩選。其中光照培養(yǎng)時光照周期為12 h/d、光照強度1 000～2 000 lx；暗培養(yǎng)時無光照，在培養(yǎng)瓶上覆黑布。觀察光暗培養(yǎng)條件下胚性愈傷組織的生長情況。

1.2.6 抗氧化劑對褐變的抑制 所用培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，另附加0，0.5，1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以確定PVP最佳質(zhì)量濃度。統(tǒng)計的褐變指標包括培養(yǎng)基中的褐變發(fā)生級別、褐變發(fā)生半徑和褐變發(fā)生高度。褐變發(fā)生級別根據(jù)褐色的深淺，劃分為無或很淺、中、深3級，分別用1、2、3表示；褐變發(fā)生半徑為褐色區(qū)域的半徑；褐變發(fā)生高度為褐色區(qū)域的豎直高度。

以上各項試驗的所有處理均附加30 g/L蔗糖，4.5 g/L瓊脂，pH值5.8，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃。除培養(yǎng)條件篩選試驗的暗培養(yǎng)處理外，其余處理為防止褐變，均于接種后先暗培養(yǎng)3 d，然后置于光照周期12 h/d、光照強度1 000～2 000 lx的條件下培養(yǎng)。所有處理均接種10瓶，每瓶3個外植體，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

由表1可知，將川滇高山櫟未成熟胚分別接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS、1/2MS、B5和WPM培養(yǎng)基上，所有基本培養(yǎng)基上均有胚性愈傷組織及體胚產(chǎn)生。其中MS基本培養(yǎng)基在接種5 d后即能夠產(chǎn)生乳白色體胚和愈傷組織(圖1-A、B)，體胚誘導(dǎo)率明顯較其他處理高；1/2 MS、B5和WPM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的體胚個數(shù)較少，愈傷組織的量也較少，且顏色偏黃；另外，所有處理均有較嚴重的褐變現(xiàn)象發(fā)生。由表1還可知，光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)2種培養(yǎng)條件下，川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)率有較明顯變化，光培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)率較高，但褐變也較重，而暗培養(yǎng)時褐變較輕；與光培養(yǎng)條件相比，除B5外，其余基本培養(yǎng)基在暗培養(yǎng)條件下的體胚誘導(dǎo)率均顯著降低。

表 1 基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

圖1 川滇高山櫟體胚的發(fā)生過程

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的2,4-D、6-BA及二者的組合，研究各處理對川滇高山櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表2。從表2可以看出，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基也能誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率較低，添加植物生長調(diào)節(jié)劑則可提高川滇高山櫟未成熟胚的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)基中只添加6-BA時，不同質(zhì)量濃度6-BA所對應(yīng)的誘導(dǎo)率存在差異，其中當6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L時，誘導(dǎo)率為36.7%，且愈傷組織量較多。培養(yǎng)基中只添加不同質(zhì)量濃度的2,4-D時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)率差異明顯，其中2,4-D質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，誘導(dǎo)率為36.7%。 6-BA與2,4-D配合使用時，未成熟胚的誘導(dǎo)率較高，愈傷組織量也相應(yīng)增加，誘導(dǎo)過程中原胚經(jīng)歷了球形期、心形期、魚雷期和子葉期等發(fā)育時期(圖1-C、D、E、F)；當1 mg/L 6-BA 與0.5 mg/L 2,4-D配合使用時，誘導(dǎo)效果顯著提高，誘導(dǎo)率高達83.3%，且愈傷組織量最多。值得注意的是，所有植物生長調(diào)節(jié)劑處理的褐變率均較高。

表 2 2,4-D與6-BA不同質(zhì)量濃度配比對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

2.3 采樣時期對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

將不同時期采集于同一母樹的川滇高山櫟未成熟合子胚統(tǒng)一接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基中，研究采樣時期對川滇高山櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，川滇高山櫟未成熟合子胚的采樣時期對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，以08-10采集的合子胚愈傷組織誘導(dǎo)率較其他采樣時期高，可產(chǎn)生大量白色透明或半透明的顆粒狀愈傷組織；06-10采集的合子胚初代培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)少量胚性愈傷組織；07-10、08-10采集的合子胚在接種5 d后即有顆粒狀愈傷組織形成，15 d后大量發(fā)生，08-10采集的合子胚褐變率較07-10的低；09-10采集的合子胚褐變率明顯增加，且愈傷組織誘導(dǎo)率急劇降低。

圖2 采樣時期對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

2.4 PVP對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中褐變的抑制作用

褐變在川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中發(fā)生較嚴重，為尋找有效減輕褐變的措施，在培養(yǎng)基中添加了不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑PVP，觀察其對褐變的抑制作用。由表3可知，不同質(zhì)量濃度PVP對控制褐變具有一定作用，在本試驗過程中，PVP質(zhì)量濃度越高抑制效果越好，當PVP為1.0 g/L時，所有褐變發(fā)生指標均明顯降低；同時隨著褐變減輕，產(chǎn)生的愈傷組織量有所增加。

表 3 PVP對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中褐變的抑制作用

3 討 論

本研究結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑配比、采樣時期、培養(yǎng)條件等均會對川滇高山櫟體胚發(fā)生產(chǎn)生影響。櫟屬植物體胚誘導(dǎo)大多以MS或WPM為基本培養(yǎng)基[16-17]，本試驗采用的4種基本培養(yǎng)基中，MS較其他培養(yǎng)基更有利于川滇高山櫟體胚的發(fā)生，可見，無機鹽含量高、微量元素齊全的MS培養(yǎng)基，除對栓皮櫟外[18]，對川滇高山櫟幼胚的體胚發(fā)生也是有利的。

櫟屬植物體胚誘導(dǎo)時，植物生長調(diào)節(jié)劑以細胞分裂素和生長素為主，一般兩者配合使用，生長素與細胞分裂素在植物體胚誘導(dǎo)中起著決定性作用[19-21]。降低或去掉生長素能提高體胚發(fā)生的誘導(dǎo)效果[22]。以川滇高山櫟未成熟合子胚為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生時，不同配比的6-BA和2，4-D均能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，但誘導(dǎo)效果存在較大差異，本試驗中以1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D的配比誘導(dǎo)效果較好。不同發(fā)育時期的未成熟合子胚因其分化程度存在差異，誘導(dǎo)率也各不相同，生長在西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)的川滇高山櫟以08-10左右采集的未成熟合子胚誘導(dǎo)率較高。

光照在體胚發(fā)生中具有較為重要的作用。櫟屬植物不同種在體胚發(fā)生中對光照的要求有較大差異，如夏櫟(Q.robur)的合子胚在暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)率較高[23]，麻櫟(Q.acutissima)和歐洲栓皮櫟(Q.suber)的合子胚則在每天16 h光照條件下培養(yǎng)體胚的誘導(dǎo)率較高[24-25]，而紅櫟(Q.rubra)在持續(xù)光照條件下具有較高的體胚誘導(dǎo)率[26]。本研究中，川滇高山櫟未成熟合子胚在光照和暗培養(yǎng)條件下均能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，但光照條件下誘導(dǎo)率較高。

木本植物組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象嚴重，材料中總酚含量與褐化程度呈正相關(guān)，這類褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中不斷擴散，抑制其他酶的活性，毒害培養(yǎng)材料，甚至導(dǎo)致其死亡，嚴重影響組織的生長。本研究在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP能減緩褐化、促進組織生長；另在操作過程中應(yīng)盡量減少機械損傷，以防止褐變。

本研究以川滇高山櫟未成熟合子胚為外植體，初步建立了川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)體系，但要真正實現(xiàn)從體胚誘導(dǎo)、體胚增殖、體胚成熟、體胚萌發(fā)以及最終的試管苗的移栽，仍有許多工作需要進一步研究完善。

[參考文獻]

[1] 尹偉倫，王華芳.林業(yè)生物技術(shù) [M].北京:科學出版社，2009.

Yin W L,Wang H F.Forestry biotechnology [M].Beijing:Science Press,2009.(in Chinese)

[2] Loureiro J,Pinto G,Lopes T,et al.Assessment of ploidy stability of the somatic embryogenesis process inQuercussuberL.using flow cytometry [J].Planta,2005,221:815-822.

[3] Santos C,Loureiro J,Lopes T,et al.Genetic fidelity analyses ofinvitropropagated cork oak (QuercussuberL.) [M]//Jain S M,Haggman H.Protocols for micropropagation of woody trees and fruits.Netherlands:Springer,2007:67-83.

[4] Chalupa V.Protocol of somatic embryogenesis:Pedunculate oak (QuercusroburL.)and sessile oak(Quercuspetraea/Matt/Liebl) [M]//Jain S M,Gupta P K.Protocol for somatic embryogenesis in woody plants.Netherlands:Springer,2005:369-378.

[5] 廖 婧，方炎明，虞木奎.麻櫟成熟合子胚外植體體胚發(fā)生和植株再生 [J].西北植物學報，2012,32(2):398-402.

Liao J,Fang Y M,Yu M K.Somatic embryogenesis and plant regeneration from mature embryo explants inQuercusacutissimaCarr [J].Acta Bot Boreal-Occident Sin,2012,32(2):398-402.(in Chinese)

[6] Okamura M,Taniguchi T,Kondo T.Efficient embryogenic callus induction and plant regeneration from embryonic axis explants inQuercusacutissima[J].J For Res,2001(6):63-66.

[7] Zhang C X,Yao Z Y，Zhao Z,et al.Histological observation of somatic embryogenesis from cultured embryos ofQuercusvariabilisB [J].Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2007,33(1):33-38.

[8] 侯德勛.云南森林 [M].北京:中國林業(yè)出版社,1986.

Hou D X.Yunnan forest [M].Beijing:China Forestry Publishing House,1986.(in Chinese)

[9] 管中天.森林生態(tài)研究與應(yīng)用 [M].成都:四川科學技術(shù)出版社，2005:650-660.

Guan Z T.Forest ecosystem research and application [M].Chengdu:Sichuan Science and Technology Press，2005：650-660.(in Chinese)

[10] Zhou Z K.Taxonomical and evolutionary in plications of the leafanatomy and architecture ofQuercusL. subgenQuercusfrom China [J].Cathaya,1995,7(22):1-34.

[11] 周浙昆，孫 航，俞宏淵.西藏殼斗科的地理分布 [J].云南植物研究,1995,17(2):144-152.

Zhou Z K,Sun H,Yu H Y.The geographical distribution of Fagaceae in Tibet [J].Yunnan Plant Research,1995,17(2):144-152.(in Chinese)

[12] 李 進，陳可詠，李渤生.川滇高山櫟群體遺傳結(jié)構(gòu)的初步研究 [J].北京林業(yè)大學學報,1997,19(2):93-98.

Li J,Chen K Y,Li B S.Preliminary study on genetic structure of Alpine Oaks in Tibet [J].Journal of Beijing Forestry University,1997，19(2)：93-98.(in Chinese)

[13] 劉興良，劉世榮，宿以明，等.巴郎山川滇高山櫟灌叢地上生物量及其對海拔梯度的響應(yīng) [J].林業(yè)科學,2006,42(2):1-7.

Liu X L,Liu S R,Su Y M,et al.Aboveground biomass ofQuercusaquifolioidesshrub community and its responses to altitudinal gradients in Balang Mountain,Sichuan Province [J].Scientia Silvae Sinicae,2006,42(2):1-7.(in Chinese)

[14] 王國嚴，羅 建，徐阿生，等.藏東南川滇高山櫟群落物種多樣性格局 [J].林業(yè)科學研究,2012,25(6):703-711.

Wang G Y,Luo J,Xu A S,et al.Pattern of plant species diversity ofQuercusaquifolioidescommunity in southeast Tibet [J].Forest Research,2012,25(6):703-711.(in Chinese)

[15] 胡宗達，劉世榮，史作民，等.不同海拔梯度川滇高山櫟林土壤顆粒組成及養(yǎng)分含量 [J].林業(yè)科學,2012,48(3):1-6.

Hu Z D,Liu S R,Shi Z M,et al.Soil particle composition and its relationship with nutrient contents in aQuercusaquifolioidesforest at different altitudinal gradient [J].Scientia Silvae Sinicae,2012,48(3):1-6.(in Chinese)

[16] 張存旭，姚增玉.櫟屬植物體細胞胚胎發(fā)生研究現(xiàn)狀 [J].西北植物學報,2004,24(2):356-362.

Zhang C X,Yao Z Y.Recently research situation of somatic embryogenesis in oak(Quercusspp.) [J].Acta Bot Boreal-Occident Sin,2004,24(2):356-362.(in Chinese)

[17] Wilhelm E.Somatic emhryogenesis in oak(Quercusspp.) [J].In Vitro Cell Dev Biol Plant,2000,36:349-357.

[18] 張存旭，姚增玉，趙 忠.栓皮櫟體胚誘導(dǎo)關(guān)鍵影響因素研究 [J].林業(yè)科學,2005,41(2):174-178.

Zhang C X，Yao Z Y,Zhao Z.Factors influencing the induction of somatic embryogenesis inQuercusvariabilis[J].Scientia Silvae Sinicae,2005,41(2):174-178.(in Chinese)

[19] 湯浩茹，王永清，任正隆.果樹的體細胞胚發(fā)生 [J].四川農(nóng)業(yè)大學學報,1999,17(1):69-79.

Tang H R，Wang Y Q,Ren Z L.Somatic embryogenesis of fruit trees [J].Journal of Sichuan Agricultural University,1999,17(1):69-79.(in Chinese)

[20] 唐 巍，楊映根，桂耀林，等.松柏類植物體細胞胚胎發(fā)生的研究與應(yīng)用 [J].植物學通報,1996,13(1):25-31.

Tang W，Yang Y G，Gui Y L，et al.Study and application on somatic embryogenesis in conifers [J].Bulletin of Botany,1996,13(1):25-31.(in Chinese)

[21] 崔凱榮，戴若蘭.植物體細胞胚發(fā)生的分子生物學 [M].北京:科學出版社，2000:53.

Cui K R,Dai R L.Molecular biology in plant somatic embryogenesis [M].Beijing:Science Press,2000:53.(in Chinese)

[22] Zhang C X,Zhang H L,Jia X M,et al.Proliferation maturation and germination of somatic embryos inQuercusvariabilis[J].Scientia Silvae Sinicae,2008,44(6):39-45.

[23] Manzanera J A,Bueno M A,Pardos J A.QuercusroburL.(pedunculate oak) [M]//Bajaj Ypa.Biotechnology in agriculture and forestry:Vol.35,Tree IV.Berlin,Netherlands:Springer,1996:321-341.

[24] Kim Y W,Youn Y,Noh E R.Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of five families ofQuercusacutissima[J].Plant Cell Rep,1997,16:869-873.

[25] Maataoui M,Espangnac H.Comportementinvitroembryons zygotiques de chne lige(QuercussuberL.)excises divers stades de leur development [J].Ann Sci For,1989,46:145-148.

[26] Gingas V M，Lineberger R D.Asexual embryogenesis and plant regeneration inQuercus[J].Plant Cell Tiss Orgeu Cult,1989,17:191-203.