王 娟，孫 毅，程 龍，宋孚陽，李 敏，劉曉明，李 勇

(寧夏大學 a 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，b 生命科學學院，寧夏 銀川 750021)

自從1997年多莉羊[1]誕生以來，體細胞核移植技術(shù)就以其在動物繁殖、品種改良及育種中的巨大潛力和廣闊前景而倍受廣大動物科技工作者的關(guān)注。目前，國內(nèi)外有許多實驗室都在進行體細胞克隆技術(shù)的研究，而建立動物體細胞體外培養(yǎng)模式是體細胞克隆生產(chǎn)的前提。

由于動物胎兒成纖維細胞具有易分離、體外培養(yǎng)生長速度快、倍增代數(shù)多、染色體倍性穩(wěn)定等特點，故大多數(shù)克隆以胎兒成纖維細胞為供體， 并已在牛[2]、山羊[3]和豬[4]上取得了成功。

灘羊?qū)儆诙讨惭颍?是中國唯一生產(chǎn)二毛裘皮用綿羊品種，與浙江湖羊、山東魯西小尾寒羊一樣，是國家二級保護品種，2001年被農(nóng)業(yè)部列入第一批畜禽品種保護名錄。灘羊體質(zhì)堅實，適應荒漠、半荒漠地區(qū)[5]，所產(chǎn)二毛裘皮獨具一格，羊毛富有光澤和彈性，為紡織提花毛毯的原料。而且，灘羊肉具有細嫩鮮美，脂肪分布均勻，無膻腥味等優(yōu)點。因此，對灘羊種質(zhì)資源特色的保護及繁育性能的改良成為灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性需求。陳亮等[6]曾以灘羊耳緣組織為材料，構(gòu)建了灘羊成纖維細胞系。本試驗以灘羊胎兒皮膚組織為材料，采用組織塊培養(yǎng)分離獲得灘羊胎兒成纖維細胞，觀測其形態(tài)和生長情況，鑒定其性別，并對其染色體核型和紅色熒光報告基因(pmCherry-N1)轉(zhuǎn)染等生物學特性進行研究，旨在將這一特有品種的遺傳資源從細胞水平保存下來，為灘羊分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

灘羊胎兒取自寧夏銀川市紅寺堡天源良種肉羊繁育場。

培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM/F12為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)為HyClone公司產(chǎn)品， 胰蛋白酶( 1∶250)、EDTA、DMSO、秋水仙素、 Giemsa、Trypan blue均為Sigma公司產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Taq酶均為全式金公司產(chǎn)品。

1.2 灘羊胎兒成纖維細胞的獲取

取妊娠灘羊的體尺為5～8 cm胎兒(約45～60 d胎齡)，置 37 ℃生理鹽水中帶回實驗室，用含有青霉素(100 IU/mL)、鏈霉素(100 IU/mL)的 PBS 洗滌3～5次，用眼科剪將灘羊胎兒皮膚剪切成 1 mm3大小的組織塊，用移液器將碎組織塊移入培養(yǎng)瓶，并均勻地平鋪于培養(yǎng)瓶底部。將培養(yǎng)瓶傾斜(以防添加培養(yǎng)液時將組織塊沖下)，加入5 mL含體積分數(shù)10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。將有皮膚小塊的一面向上放入培養(yǎng)箱，于體積分數(shù)5% CO2、38.5 ℃和飽和濕度下靜置4 h后，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來[7]，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，盡量避免組織塊浮起，然后繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液。

1.3 灘羊胎兒成纖維細胞的純化與培養(yǎng)

根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶消化敏感性的不同及二者貼壁速度的差異，可以將二者分離。在混合生長的原代細胞中，棄除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入無血清PBS漂洗1次，然后加入2 mL孵育好的2.5 g/L胰蛋白酶，在38.5 ℃的培養(yǎng)箱中作用2 min，待70%的細胞脫壁、變圓、分離成單個細胞時輕輕拍打，使細胞脫離瓶壁，立即加入4 mL含體積分數(shù)10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，將消化后的細胞混合液加入10 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入細胞培養(yǎng)液重懸，根據(jù)需要接種到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過2～3次選擇傳代，可完全純化成纖維細胞，形成成纖維細胞系。以后視細胞生長和代謝物情況換液，待細胞生長至70%～90% 匯合時進行傳代。

1.4 灘羊胎兒成纖維細胞的凍存及復蘇

1.4.1 細胞凍存 處在對數(shù)生長期的成纖維細胞在凍存前24 h更換新的完全培養(yǎng)液。按常規(guī)傳代方法消化細胞，制備成單細胞懸液，將單細胞懸液收集于10 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液，收集細胞；加入4 ℃預冷的凍存液(DMEM+體積分數(shù)30% FBS+體積分數(shù)10% DMSO)，將懸液分裝于無菌塑料凍存管中，嚴密封口，并注明細胞名稱、培養(yǎng)代數(shù)、凍存編號、凍存日期等。將凍存管放在4 ℃冰箱中40～60 min，然后懸掛在液氮液面以上過夜，次日放入液氮罐中分類保存[8]。

1.4.2 細胞復蘇 將凍存的細胞快速從液氮中取出，快速投入39 ℃水浴中，并在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍，待冷凍液徹底解凍后， 加孵育好的新鮮培養(yǎng)液稀釋至4～5 mL，并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，再以1 000 r/min離心5 min，以達到去除DMSO以緩解冷凍液毒性，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細胞沉淀，將細胞稀釋至所需濃度，接種培養(yǎng)[9]。

1.5 灘羊胎兒成纖維細胞的生物學特性檢測

1.5.1 細胞生長曲線 消化對數(shù)生長期的成纖維細胞，制成細胞懸液，計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，將細胞密度調(diào)整至大約4×104個/mL，接種培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液，每隔24 h收集4個孔的細胞并計數(shù)，取平均值，接種日期記為0 d,連續(xù)記錄7 d。將計數(shù)結(jié)果輸入計算機處理，繪制細胞生長曲線圖，并求得細胞群體倍增時間參數(shù)[10]。

1.5.2 成纖維細胞系的性別鑒定 參照天根全基因組提取試劑盒操作說明書，取部分灘羊胎兒成纖維細胞提取基因組DNA。

根據(jù)GenBank 已發(fā)表的綿羊Sry基因序列(GenBank號：JN992673.1)設計1對引物，上游引物:5′-AGC GGT GGT ACA GCAACA AA-3′；下游引物:5′-TGT GCC TCC TCA AAAGAAT GG-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。PCR反應體系：待測 DNA 樣品2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 38.5 μL，總體積 50 μL。反應條件：94 ℃ 45 s；59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。取PCR產(chǎn)物進行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.3 細胞染色體制備與核型分析 取純化后5代、15代和25代的對數(shù)生長期成纖維細胞，加入含0.1 μg/mL秋水仙素的DMEM/F12培養(yǎng)液6～8 mL培養(yǎng)4～6 h，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，逐滴加入37 ℃預熱的0.075 mol/L KCl 10 mL，37 ℃低滲處理20～30 min，1 000 r/min離心5 min。棄上清，向沉淀細胞加入現(xiàn)配制的固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)1 mL，預固定5 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加現(xiàn)配制固定液10 mL懸浮細胞，室溫靜置30 min， 1 000 r/min離心10 min，棄上清液，再固定1次。向2次固定后的細胞沉淀中加固定液，根據(jù)細胞數(shù)量的多少制成細胞懸液，用微細管吸取細胞懸液，在距載玻片上方大于1 m處滴于-20 ℃冰凍載玻片上。過酒精燈火焰，使其快速干燥或自然干燥，然后用姬姆薩磷酸緩沖液(V(姬姆薩原液)∶V(磷酸緩沖液)=1∶9)染色15 min，流水沖洗40 s，自然干燥或酒精燈加熱干燥，樹膠封片，姬姆薩染色后，油鏡下觀察并拍照，對鋪展完好的中期相統(tǒng)計染色體數(shù)目[12]。

1.5.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h,將成纖維細胞以2×105個/孔的量接種到六孔細胞培養(yǎng)板，每孔加2 mL培養(yǎng)基。在38.5 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達到70%～80%匯合時，備用。將4 μg攜帶有紅色熒光報告基因質(zhì)粒(pmCherry-N1)的DNA在400 μL opti-mem培養(yǎng)液中稀釋，再加5 μL puls混勻靜置5 min后，加入8 μL Lipofectamine LTX小心混勻，室溫下靜置30 min，形成DNA-脂質(zhì)體混合物。將混合物加入六孔板中，12 h后換含體積分數(shù)10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)， 24 h后傳代加入G-418，對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選。對篩選出的細胞進行生長動力學和核型分析，以檢測轉(zhuǎn)染后灘羊胎兒成纖維細胞生長能力和遺傳物質(zhì)的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)

灘羊胎兒組織塊貼壁后第2天即可見到細胞從組織塊邊緣向外生長，成纖維細胞和上皮細胞均有，隨后迅速向外擴散， 培養(yǎng)3 d左右80%～90%細胞可匯合(圖1A)， 此時進行細胞傳代， 之后成纖維細胞生長逐漸占優(yōu)勢，再傳代2～3次便可得到純化的灘羊胎兒成纖維細胞。灘羊胎兒成纖維細胞呈梭形、長條形、多角形或不規(guī)則形。多數(shù)情況下，細胞之間排列疏松，有較大細胞間隙，有時也有平行排列，成群細胞呈放射狀或漩渦狀分布(圖1B)。

圖1 灘羊胎兒成纖維細胞

2.2 灘羊胎兒成纖維細胞的生長曲線

連續(xù) 7 d定時計數(shù)接種于 24孔培養(yǎng)板的細胞，記錄各次細胞密度，繪制成細胞生長曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，灘羊胎兒成纖維細胞生長總體趨勢均呈“S”型，并沒有因為傳代次數(shù)的增加而發(fā)生改變。細胞生長共經(jīng)歷了潛伏生長期、對數(shù)生長期和平臺生長期3個時期。剛剛接種細胞均有 24 h的潛伏期，此期為細胞的適應階段，是細胞由于接種時胰蛋白酶消化而致的損傷后的修復時期；接種第2天起細胞進入對數(shù)生長期，其倍增時間約為48 h，這是細胞生長最快的時期；從第5天起細胞生長緩慢，進入平臺生長期，隨后可見有細胞死亡，這是由于細胞缺乏生長可利用的空間，出現(xiàn)接觸抑制和密度抑制所致。

圖2 灘羊胎兒成纖維細胞生長曲線

2.3 灘羊胎兒成纖維細胞系的性別鑒定

共檢測了5個灘羊胎兒成纖維細胞系樣品，結(jié)果(圖3)顯示，1、2號樣品無特異性擴增帶，可以判斷這2個細胞系為雌性；3、4、5號樣品均擴增出約130 bp的特異性條帶，說明這3個細胞系為雄性。

圖3 灘羊胎兒成纖維細胞系的性別鑒定

2.4 灘羊胎兒成纖維細胞的染色體分析

在油鏡下觀察灘羊胎兒成纖維細胞的染色體標本的形態(tài)并計數(shù)，每代細胞隨機選取10個中期分裂細胞染色體進行統(tǒng)計分析，結(jié)果(圖4)表明，5代、15代和25代灘羊染色體全部為 2n=54。說明所研究的灘羊胎兒成纖維細胞染色體數(shù)目為 2n=54，為穩(wěn)定的二倍體細胞系，且未隨著傳代次數(shù)的增加造成染色體的缺失，可以作為體細胞核移植的供體細胞。

圖4 不同代數(shù)灘羊胎兒成纖維細胞的染色體及核型分析(×1 000)

2.5 灘羊胎兒成纖維細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染標記基因

灘羊胎兒成纖維細胞轉(zhuǎn)染pmCherry-N1重組質(zhì)粒后12 h，可見部分細胞發(fā)紅色熒光，分布較松散，亮度較弱(圖5A)；24 h 陽性細胞明顯增多，低倍鏡視野內(nèi)可見 50%左右，未轉(zhuǎn)染細胞則無熒光顯示(圖5B)；轉(zhuǎn)染24 h后，傳代加入藥物，經(jīng)過1周的篩選，可觀察到無熒光細胞均已死亡，陽性細胞亮度增強(圖5C)。

圖5 pmCherry-N1轉(zhuǎn)染灘羊胎兒成纖維細胞(×100)

對篩選后的第5代、10代灘羊胎兒成纖維細胞進行染色體核型分析，并繪制生長曲線，結(jié)果見圖6和圖7。染色體核型分析結(jié)果(圖6)表明，第5代、10代單克隆轉(zhuǎn)染細胞染色體全部為2n= 54，說明轉(zhuǎn)染后的灘羊胎兒成纖維細胞染色體沒有發(fā)生缺失情況，且藥物的篩選也沒有對灘羊胎兒成纖維細胞的遺傳物質(zhì)造成改變。由圖7可知，獲得的單克隆轉(zhuǎn)染細胞生長總體趨勢呈“S”型，與正常成纖維細胞的生長曲線相同，都包括潛伏生長期、對數(shù)生長期和平臺生長期3個時期，且單克隆轉(zhuǎn)染細胞的生長趨勢并未因為傳代次數(shù)的增加而有所改變。

圖6 不同代數(shù)轉(zhuǎn)染pmCherry-N1灘羊胎兒成纖維細胞的染色體及核型分析(×1 000)

圖7 轉(zhuǎn)染pmCherry-N1質(zhì)粒后灘羊胎兒成纖維細胞生長曲線

3 討 論

3.1 成纖維細胞分離方法的選擇

原代細胞分離方法主要有組織塊法和酶消化法。對于胎兒成纖維細胞的原代培養(yǎng)，有的采用組織塊法，有的采用酶消化法，有的進行原代培養(yǎng)時2種方法都采用[13]。在酶消化法中酶作用時間長易對細胞產(chǎn)生損傷，損傷后的細胞不易貼壁，而灘羊的體細胞核移植對供體的選擇要求嚴格，細胞必須具有高活力。組織塊法具有操作簡便，對組織、細胞損傷小，污染機率小，成功率高等優(yōu)點，適用于各種細胞培養(yǎng)，因此本試驗采用組織塊法分離培養(yǎng)灘羊胎兒成纖維細胞，為核移植提供了量足質(zhì)優(yōu)的供體細胞。組織貼壁是組織塊法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 只有貼壁后細胞才能很好地生長。本試驗發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)時，先將組織塊貼在底壁上，組織塊帶有少量培養(yǎng)液為宜，然后倒置在培養(yǎng)箱中4 h 后加入培養(yǎng)液，一般培養(yǎng)1 d后有細胞長出。本試驗要構(gòu)建細胞系，樣本含量小，而且組織塊小，因此選擇組織塊貼壁培養(yǎng)較為合適。

3.2 成纖維細胞的性別鑒定

Sry基因的表達決定了胚胎沿雄性方向分化，特異性擴增Sry基因的核心序列就可以對動物胚胎或細胞進行性別鑒定。本試驗根據(jù)綿羊Sry基因同源序列設計的這對引物，通過一次擴增反應，能有效地擴增出雄性灘羊Sry基因的一段近130 bp特異性片段，由此可判斷有130 bp 擴增帶的細胞系為雄性,而無此帶的為雌性。這為轉(zhuǎn)基因克隆動物研究中及早地轉(zhuǎn)染目的基因，以及保存和擴增性別已知的胎兒成纖維細胞系提供了可靠的依據(jù)。

3.3 成纖維細胞的染色體分析

染色體數(shù)目及核型能鑒定細胞是否趨于穩(wěn)定，以及在離體培養(yǎng)條件下細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化。在細胞培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件的變化和其他不利因素的影響，細胞生物學性狀可能發(fā)生變化。隨著細胞培養(yǎng)時間的延長和傳代次數(shù)的增加，不僅會導致細胞停止生長，甚至失掉二倍體性狀，因此以資源保存為目的的細胞培養(yǎng)要保證二倍體的穩(wěn)定性就顯得尤為重要。本試驗結(jié)果表明，灘羊胎兒成纖維細胞染色體數(shù)目為 2n=54，為穩(wěn)定的二倍體細胞系，且沒有隨著傳代次數(shù)的增加造成染色體的缺失，可以作為體細胞核移植的供體細胞。

3.4 成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)目前被廣泛應用于各種基因結(jié)構(gòu)與功能以及基因調(diào)控等研究領(lǐng)域。本研究使用的 Lipofectamine LTX是人工合成的陽離子脂質(zhì)體，它和帶負電荷的櫻桃紅熒光蛋白報告基因質(zhì)粒(pmCherry-N1)結(jié)合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內(nèi)吞進入細胞質(zhì)，隨后 DNA 復合物被釋放進入細胞核內(nèi)。本試驗結(jié)果表明，所建的灘羊胎兒成纖維細胞系的細胞轉(zhuǎn)染效率較高，約為50%，說明外源基因能在灘羊胎兒成纖維細胞內(nèi)進行有效的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及正確翻譯后修飾，且外源基因表達所需的一些調(diào)控元件也能在這種成纖維細胞中有效工作[14]。轉(zhuǎn)染后灘羊胎兒成纖維細胞染色體沒有發(fā)生缺失情況，說明轉(zhuǎn)染沒有造成灘羊胎兒成纖維細胞遺傳物質(zhì)的改變，細胞可以滿足供體細胞的要求。

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