李碧俠，趙 芳，付言峰，任守文,王金玉

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2 揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 (Silent information regulator 2，SIR2)是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)家庭成員之一，參與了酵母交配型基因、端粒區(qū)基因和rDNA沉默，并可抑制rDNA的重組，增加1個拷貝的SIR2基因可延長酵母的壽命，延緩其衰老[1-3]。哺乳動物去乙?；窼irtuins家族有7個成員(SIRT1～SIRT7)，其中SIRT1與SIR2的同源性最高，因此受到廣泛關(guān)注。SIRT1在體內(nèi)通過對幾種控制代謝及內(nèi)分泌信號的轉(zhuǎn)錄因子的去乙酰化作用來調(diào)節(jié)其活性，從而廣泛參與哺乳動物細(xì)胞壽命的不同信號通路、糖代謝及胰島素分泌等多條代謝通路，參與眾多基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝及細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)過程[4-6]。隨著對SIRT1基因生理功能研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)SIRT1基因除了在脂肪代謝、糖代謝、抗氧化等方面發(fā)揮作用外，其還通過對生殖激素受體表達(dá)的調(diào)控參與動物生殖過程[7]。SIRT1基因與黃體生成素、雌激素分泌存在密切相關(guān)性，直接或間接參與生殖調(diào)控[8]。

目前，關(guān)于豬SIRT1基因的研究報道很少，豬作為一個良好的動物模型，在研究能量代謝、生殖激素調(diào)控等方面有重要作用。卵泡是卵巢最基本的功能單位，為卵子的發(fā)育和成熟提供微環(huán)境。卵泡發(fā)育是一個以形態(tài)變化為特征的不可逆的生長過程，同時伴隨著卵泡功能的分化。因此，本研究分析SIRT1基因在豬卵泡發(fā)育中的變化規(guī)律，探討了SIRT1基因的表達(dá)與卵泡發(fā)育的相關(guān)性，以期為研究SIRT1基因在豬卵巢卵泡發(fā)育、發(fā)情排卵中的作用及其生物學(xué)特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗豬由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合蘇鐘豬原種場提供，采集新鮮健康的豬卵巢，置于37 ℃生理鹽水(添加青霉素和鏈霉素)中，2 h內(nèi)帶回實驗室。

1.2 主要儀器與試劑

動物切片石蠟(熔點 60～62 ℃)購自上海標(biāo)本模型廠，Trizol試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer、SYBR Premix ExTaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品， SIRTl抗體購自Santa Cruz公司。主要儀器有：Bio-Rad Iq5型熒光定量PCR儀、SZ-51連續(xù)變倍體視顯微鏡、Leica倒置熒光顯微鏡及BIO-RAD電泳凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 豬卵泡的分離與分類

將采集的卵巢用PBS清洗后，用眼科剪將卵巢剪開，再用鑷子在體視鏡下人工剝離單個卵泡，根據(jù)直徑將卵泡分為≤1.5 mm，>1.5～≤3.0 mm，>3.0～≤5.0 mm，>5.0 mm 4個組。

1.4 豬卵泡顆粒細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測

采集新鮮母豬卵巢，用PBS清洗后放入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定，6 h后修塊1次，共固定24 h，常規(guī)方法制備石蠟切片。取石蠟切片，用二甲苯脫蠟3次，每次6 min；水化、抗原熱修復(fù)，用體積分?jǐn)?shù) 3%甲醇處理1 h，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；加SIRT1抗體(稀釋倍數(shù)1∶150)，室溫過夜；加二抗，濕盒內(nèi)37 ℃反應(yīng)1 h；加ABC 復(fù)合物(稀釋倍數(shù) 1∶50)，37 ℃作用30 min；用PBS稀釋的體積分?jǐn)?shù)0.05% DAB+體積分?jǐn)?shù)0.01% H2O2顯色2～15 min；流水沖洗 2 min 后用蘇木精復(fù)染，于顯微鏡下觀察，根據(jù)染色情況終止染色。切片重新脫水，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察SIRT1表達(dá)情況。棕褐色指示陽性表達(dá)，染色的深淺程度指示蛋白表達(dá)的強弱。

1.5 豬卵泡顆粒細(xì)胞SIRT1 mRNA 表達(dá)的qRT-PCR檢測

根據(jù)GenBank已公布的豬SIRT1基因序列(GenBank號：EU200984.1)設(shè)計1對引物，其上游引物為：5′-ATTCTTGTGAAAGTGATGAGGAT-G-3′，下游引物為：5′-ATTGTTCGAGGATCTGTGCC-3′,擴增目的片段長度為130 bp。同時，根據(jù)GenBank已公布的豬管家基因GAPDH序列(GenBank號：NC_010447.3) 設(shè)計1對引物，其上游引物為：5′-TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3′，下游引物為：5′-TGGGTGGAATCATACTGGAAC-3′，擴增目的片段長度為148 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用Trizol法提取不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取RNA的完整性。將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以合成的cDNA為模板，采用熒光定量PCR方法檢測SIRT1基因表達(dá)量，PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包括SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，去離子水10.5 μL，cDNA模板1 μL。試驗同時設(shè)無模板試劑對照。PCR反應(yīng)條件均設(shè)置為：94 ℃ 預(yù)變性10 s；然后94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，重復(fù)35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷目的基因擴增效果與管家基因擴增效果是否一致。

1.6 豬卵泡顆粒細(xì)胞SIRT1 蛋白表達(dá)的Western blotting檢測

提取不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每處理設(shè)3個重復(fù)。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，加入適宜濃度的一抗，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，然后用化學(xué)發(fā)光液浸潤PVDF膜蛋白面，并以ChemiDoc XRS曝光系統(tǒng)檢測蛋白條帶亮度。以Tubulin蛋白為內(nèi)參，用Quantity One(Bio-Rad，USA)軟件分析蛋白條帶密度值。各組織的SIRT1蛋白光密度值除以Tubulin蛋白光密度值，即獲得SIRT1蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計分析

每種處理試驗均重復(fù)3次，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1表達(dá)量的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬不同發(fā)育階段卵泡中SIRT1蛋白的表達(dá)定位

采用免疫組織化學(xué)方法分析SIRT1蛋白在豬不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá)定位，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白在豬原始卵泡(圖1-A)中表達(dá)量較少；而在初級卵泡(圖1-B)、次級卵泡(圖1-C)、三級卵泡(圖1-D)、優(yōu)勢卵泡(圖1-E)中均有較強表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)SIRT1蛋白表達(dá)主要定位于顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中，膜細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)量較少。

圖1 豬不同發(fā)育階段卵泡中SIRT1蛋白的表達(dá)定位

2.2 豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)量

利用qRT-PCR方法分析不同直徑大小卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在直徑為>1.5～≤3.0 mm的卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)量最高，直徑>5.0 mm的卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)量最低；直徑≤1.5 mm組和>1.5～≤3.0 mm組卵泡中SIRT1 mRNA表達(dá)量均極顯著高于直徑>3.0～≤5.0 mm和>5.0 mm組(P<0.01)，直徑>3.0～≤5.0 mm與>5.0 mm組間差異不顯著(P>0.05)。

表 1 豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA的相對表達(dá)量

2.3 豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1 蛋白的表達(dá)量

Western blotting結(jié)果(表2)表明,SIRT1蛋白在豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，其中在直徑為>1.5～≤3.0 mm卵泡中SIRT1蛋白表達(dá)量極顯著高于其他直徑的卵泡(P<0.01),直徑>3.0～≤5.0 mm與>5.0 mm卵泡中SIRT1蛋白表達(dá)量差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。SIRT1蛋白在不同直徑大小的卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)趨勢與SIRT1 mRNA表達(dá)趨勢一致。

表 2 豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中SIRT1蛋白的相對表達(dá)量

3 討 論

目前，研究已發(fā)現(xiàn)SIRT1基因參與哺乳動物脂肪代謝、糖代謝、胰島素分泌等多條信號通路，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝及細(xì)胞衰老[9-10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠的SIRT1基因與卵巢孕酮、雌激素分泌密切相關(guān)。SIRT1基因敲除雄性小鼠與促黃體生成素(LH)、促黃體生成素受體(LHR)、促性腺激素釋放激素(GnRH)編碼基因突變個體表現(xiàn)出相似的表型[11]。SIRT1基因敲除雄性小鼠睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞成熟功能缺失，睪丸內(nèi)睪酮水平下降，表現(xiàn)出雄性不育[12]。SIRT1基因敲除雌性小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素水平顯著升高[13]。但豬SIRT1基因?qū)ι痴{(diào)控影響的研究尚未見報道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法分析豬不同發(fā)育階段卵泡中SIRT1 蛋白的表達(dá)與定位，結(jié)果顯示，隨著卵泡的發(fā)育，SIRT1 蛋白表達(dá)量逐漸增多，其在原始卵泡中表達(dá)最弱，在優(yōu)勢卵泡中表達(dá)最強。在人的卵巢組織中，用免疫組織化學(xué)方法也發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育卵泡顆粒細(xì)胞中均存在SIRT1 蛋白的表達(dá)[14]。在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中也存在SIRT1基因表達(dá)，且其表達(dá)量可影響顆粒細(xì)胞分泌雌激素的能力[15-16]。

本試驗為了進(jìn)一步分析SIRT1基因在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，體外根據(jù)卵泡直徑將其分為4組，qRT-PCR 和Western blotting結(jié)果表明，SIRT1蛋白和SIRT1 mRNA在豬不同直徑卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)規(guī)律一致。隨著卵泡直徑的變化，SIRT1蛋白和SIRT1 mRNA表達(dá)量逐漸增多，在直徑>1.5～≤3.0 mm卵泡中表達(dá)量最高，在直徑>5.0 mm的優(yōu)勢卵泡中表達(dá)量最小。根據(jù)研究報道，直徑>1.5～≤3.0 mm的卵泡多處于腔前卵泡向有腔卵泡的過渡階段，閉鎖率最高[17]，具體的原因還需進(jìn)一步研究。以上結(jié)果說明，SIRT1基因的表達(dá)量與卵泡發(fā)育存在較大的相關(guān)性，可能在卵泡發(fā)育過程中起著重要作用。

綜上所述，豬SIRT1基因在不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量具有一定的規(guī)律性，其表達(dá)量與卵泡發(fā)育存在相關(guān)性，可能參與卵泡的發(fā)育調(diào)控，但具體調(diào)控機制需進(jìn)一步研究。

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