溫 嘯,賀大方,倪學(xué)勤,張 丹,丁艷東,辛金鴿,李利杰,曾 東
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物微生態(tài)研究中心,四川 雅安 625014)
高血脂癥是當(dāng)今社會(huì)常見(jiàn)的一種疾病,發(fā)病率在逐年上升,已被稱(chēng)為人類(lèi)健康的三大殺手之一。高血脂除導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,誘發(fā)冠心病、腦中風(fēng)、心肌梗塞等疾病外[1],還會(huì)誘發(fā)高血壓、高血糖、脂肪肝等嚴(yán)重疾病,對(duì)人體健康危害嚴(yán)重[2]。因此,研發(fā)能夠降低血脂的保健藥品,對(duì)預(yù)防疾病、保護(hù)身體健康具有重要意義。然而,在高血脂癥新型保健食品的開(kāi)發(fā)及新藥研究中,常見(jiàn)的降脂藥物雖對(duì)血脂有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用,但副作用也較明顯,在治療疾病的同時(shí)也會(huì)留下不少后遺癥[3],所以,研制既安全有效、又無(wú)毒副作用的降脂藥物,成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)重要課題。
研究表明,中藥對(duì)益生菌的增殖有促進(jìn)作用,將有益菌與中藥聯(lián)合應(yīng)用,不僅具有無(wú)毒、無(wú)害和無(wú)污染的特點(diǎn),而且還可通過(guò)相互的促進(jìn)作用加強(qiáng)療效[4-5]。乳酸菌作為微生態(tài)制劑,具有減少血清中的膽固醇含量、降低心血管疾病發(fā)病率,抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的功效[6],被認(rèn)為是一種具有多重降血脂作用的微生物。人體臨床試驗(yàn)也表明,口服乳酸菌可以對(duì)總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)水平產(chǎn)生有益作用[7-8]。銀杏葉(Ginkgobiloba)具有多種藥理功能[9],其有效活性成分主要是銀杏萜內(nèi)酯類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物,是天然的自由基清除劑,具有抗氧化以及改善缺血心肌功能等生理功效[10]。銀杏葉提取物(EGb)具有降低SD大鼠血清中膽固醇含量的作用[11]。由以上研究結(jié)果可知,乳酸菌和銀杏葉提取物均具有降低血脂的作用,但是有關(guān)兩者的比較及聯(lián)合作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究擬通過(guò)建立小鼠高脂血癥模型,研究乳酸菌、銀杏葉提取物及二者混合液對(duì)高脂血癥小鼠的降血脂及抗氧化效果,以期為生物降血脂療法的研究與應(yīng)用提供新的思路,為開(kāi)發(fā)安全、無(wú)毒副作用的降脂藥品奠定基礎(chǔ)。
銀杏葉提取物(EGb,含質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%黃酮苷和6%銀杏內(nèi)酯)購(gòu)于四川同泰植物化工有限公司;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)干酪亞種K1,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供;雌性小鼠60只,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)龍鼠家園提供,體質(zhì)量(20±1.0) g/只;MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,酵母膏粉4 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,磷酸氫二鉀2 g,乙酸鈉5 g,檸檬酸三銨0.2 g,磷酸鎂0.2 g,硫酸錳0.05 g。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自南京建成生物研究所。
全自動(dòng)生化分析儀GS200,深圳市錦瑞電子有限公司產(chǎn)品;AL204電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀WD-2102A,北京市六一儀器廠產(chǎn)品。
1.3.1 干酪乳桿菌菌液的制備 將干酪乳桿菌K1菌株涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑取單一菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)32~36 h后備用。
在無(wú)菌條件下,取1 mL培養(yǎng)后的干酪乳桿菌菌液加入裝有99 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中,用漩渦振蕩器振蕩10 min,使試樣混合均勻,即成 10-2稀釋液,然后無(wú)菌條件下10倍稀釋?zhuān)謩e從10-5,10-6和10-73個(gè)稀釋度試管中取0.1 mL稀釋液,涂布接種于MRS瓊脂平板上,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。37 ℃厭氧培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行計(jì)數(shù)。在灌胃前,樣品均以PBS溶液制成108CFU/mL的懸液,臨用時(shí)新鮮配制。
1.3.2 銀杏葉提取物溶液的配制 將銀杏葉提取物加溫(37 ℃)配成質(zhì)量濃度為41.7 mg/mL的銀杏葉提取物溶液,因銀杏葉提取物中黃酮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%,換算可知銀杏葉提取物溶液中黃酮苷的質(zhì)量濃度約為10 mg/mL。本試驗(yàn)中若以每千克體質(zhì)量100 mg的黃酮苷量灌胃小鼠,則每只小鼠((20±1.0) g)約需灌胃銀杏葉提取物溶液0.2 mL[12]。
1.3.3 高脂飼料的制備 在基礎(chǔ)飼料[13]的基礎(chǔ)上,參照文獻(xiàn)[11]的方法改良配制高脂飼料。高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為:膽固醇2%,膽酸鈉0.5%,丙硫氧嘧啶0.2%,蔗糖5%,豬油10%,基礎(chǔ)飼料82.3%。
1.3.4 試驗(yàn)分組及血清樣品的制備 將60只健康雌性小鼠飼養(yǎng)在干燥、清潔、通風(fēng)良好的環(huán)境中,溫度控制在(24±1) ℃,預(yù)飼1周基礎(chǔ)飼料后,將小鼠隨機(jī)分成5組,每組12只,試驗(yàn)1組為空白對(duì)照組,飼喂基礎(chǔ)飼料并灌胃0.2 mL/(只·d) PBS緩沖液;試驗(yàn)2組為高脂對(duì)照組,飼喂高脂飼料并灌胃0.2 mL/(只·d) PBS緩沖液;試驗(yàn)3組為干酪乳桿菌組,飼喂高脂飼料并灌胃0.2 mL/(只·d)干酪乳桿菌菌液;試驗(yàn)4組為銀杏葉提取物組,飼喂高脂飼料并灌胃0.2 mL/(只·d)銀杏葉提取物溶液;試驗(yàn)5組為干酪乳桿菌與銀杏葉提取物混合組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為混合組),飼喂高脂飼料并灌胃0.1 mL/(只·d) 銀杏葉提取物溶液和0.1 mL/(只·d)干酪乳桿菌菌液。
將各組小鼠分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。飼喂30 d后各組隨機(jī)選擇10只小鼠稱(chēng)體質(zhì)量。禁食10 h后,用乙醚麻醉,從眼眶采血0.5 mL。室溫下靜置30 min,3 500 r/min離心10 min,分離血清備用。
1.3.5 指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀GS200測(cè)定血清中的總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總蛋白(TP)濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)丙二醛(MDA)濃度及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,差異顯著者再采用Duncan法進(jìn)行多重比較,數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
由表1可以看出,高脂對(duì)照組(試驗(yàn)2組)小鼠血清中的TG、TC濃度以及體質(zhì)量與空白對(duì)照組(試驗(yàn)1組)相比差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05),證明肥胖模型建模成功。高脂對(duì)照組、銀杏葉提取物組(試驗(yàn)4組)和干酪乳桿菌組(試驗(yàn)3組)的小鼠體質(zhì)量與空白對(duì)照組都存在顯著性差異(P<0.05),銀杏葉提取物組的小鼠體質(zhì)量與高脂對(duì)照組之間存在顯著性差異(P<0.05),空白對(duì)照組(試驗(yàn)1組)和混合組(試驗(yàn)5組)的小鼠體質(zhì)量與高脂對(duì)照組之間均存在極顯著差異(P<0.01),且空白對(duì)照組的體質(zhì)量與混合組基本相近。銀杏葉提取物組、干酪乳桿菌組和混合組小鼠的TG水平與高脂對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P<0.01),其中混合組的TG值與空白對(duì)照組小鼠相近。與高脂對(duì)照組相比,銀杏葉提取物組、干酪乳桿菌組和混合組的TC水平均較低,但只有混合組與高脂對(duì)照組之間存在極顯著差異(P<0.01)。銀杏葉提取物組和混合組的HDL-C均高于高脂對(duì)照組并存在極顯著性差異(P<0.01),其中混合組的HDL-C水平最高,且極顯著高于空白對(duì)照組。混合組的LDL-C水平較高脂對(duì)照組有所降低,但干酪乳桿菌組的作用效果最好。
表 1 干酪乳桿菌與銀杏葉提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量及血脂濃度的影響
由表2可以看出,雖然各組小鼠的TP和ALB濃度無(wú)明顯差別,但混合組的TP濃度低于其他組,而ALB濃度高于干酪乳桿菌組和銀杏葉提取物組,低于高脂對(duì)照組和空白對(duì)照組。干酪乳桿菌組的GLU濃度顯著低于高脂對(duì)照組(P<0.05),ALT濃度也低于其他各組(P>0.05)。
表 2 干酪乳桿菌與銀杏葉提取物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響
由表3可見(jiàn),混合組的CAT活性與高脂模型組和空白對(duì)照組之間均呈極顯著性差異(P<0.01),說(shuō)明干酪乳桿菌和銀杏葉提取物混合可以有效降低肥胖小鼠的CAT活性。相對(duì)于高脂對(duì)照組,只有混合組的GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),說(shuō)明干酪乳桿菌與銀杏葉提取物混合可以有效提高小鼠血清中GSH-Px的活性。與高脂對(duì)照組小鼠相比,混合組可以降低小鼠血清中MDA濃度,SOD活性也有所降低,接近空白對(duì)照組小鼠的SOD水平。
表 3 干酪乳桿菌與銀杏葉提取物對(duì)小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和 MDA 濃度的影響
高血脂癥是由于脂肪攝入過(guò)多或脂質(zhì)代謝障礙等因素所引起的血漿中脂質(zhì)持續(xù)升高的一種異常生化表現(xiàn)[14]。有資料證明,血液中TC、TG濃度與冠心病發(fā)病率有明顯的正相關(guān)性,HDL-C濃度與心血管疾病的發(fā)病率、動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)性[15]。且流行病學(xué)資料已表明,HDL-C濃度升高可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生,轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì),對(duì)血管具有保護(hù)作用[16]。近幾十年來(lái)的有關(guān)研究表明,改善血脂代謝紊亂可以明顯降低冠心病的發(fā)病率和死亡率。
銀杏葉提取物(EGb)中的黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯可改善人體心血管功能,其水提物有降血脂作用[17]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,EGb通過(guò)清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用而降脂[18],可有效預(yù)防和治療高血脂癥。乳酸菌作為非藥物治療的生物降血脂法,具有專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和及降解效率高等特點(diǎn),乳酸菌通過(guò)同化作用、共沉淀作用、吸收作用、共沉淀與吸收的共同作用,在一定的 pH 條件下吸收膽固醇發(fā)生共同沉淀,通過(guò)膽固醇還原酶途徑降低膽固醇[7]。本研究發(fā)現(xiàn),與高脂對(duì)照組相比,單獨(dú)使用干酪乳桿菌或銀杏葉提取物均對(duì)小鼠體質(zhì)量和血脂指標(biāo)有調(diào)節(jié)作用,與文獻(xiàn)報(bào)道[7,17-18]相似。但與高脂對(duì)照組相比,干酪乳桿菌與銀杏葉提取物協(xié)同作用后,小鼠體質(zhì)量降低13.22%,TC和TG降解率分別達(dá)到24.48%和20.93%;小鼠血清中HDL-C增加167.85%,表明干酪乳桿菌與銀杏葉提取物具有協(xié)同作用,可以降低血清TC、TG的濃度,促進(jìn)HDL-C的生成,減輕小鼠體質(zhì)量,通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪代謝,進(jìn)而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)可以減少活性氧自由基的產(chǎn)生,防止脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體組織造成損害[19]。超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因此,測(cè)定血清中GSH-Px和SOD的活性,可以間接反映機(jī)體清除自由基的能力。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物,其含量高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,測(cè)定血清中MDA含量,可以間接反映細(xì)胞受氧化損傷的程度[20]。有研究表明,EGb能直接清除超氧陰離子及氧自由基,降低血清活性氧含量、黃嘌呤氧化酶活性,并可增強(qiáng)GSH-Px、SOD、CAT的活性[21]。而大多數(shù)乳酸菌是通過(guò)產(chǎn)SOD和GSH-Px來(lái)清除羥自由基和過(guò)氧化氫的,對(duì)人體而言,乳酸菌中的一些抗氧化物質(zhì)能被腸道吸收而抑制血液中低密度脂蛋白(LDL)的氧化作用[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與高脂對(duì)照組相比,干酪乳桿菌或銀杏葉提取物單獨(dú)使用都可以提高小鼠血清抗氧化作用,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[7,17,21]相似;而干酪乳桿菌與銀杏葉提取物協(xié)同作用后,GSH-Px活性提高了13.14%,CAT和SOD活性及MDA濃度降低了49.01%,3.1%和6.0%,比單獨(dú)使用干酪乳桿菌或銀杏葉提取物的效果更好。這可能是由于,銀杏葉提取物對(duì)干酪乳桿菌的活性產(chǎn)生了促進(jìn)作用,或者是干酪乳桿菌代謝銀杏葉提取物產(chǎn)生了新的活性物質(zhì),具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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