夏小成，劉曉穎

(1．江蘇科技大學，江蘇鎮(zhèn)江212018；2．中國農業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春130112)

布魯氏桿菌(BrucellaBlues)屬于革蘭氏陰性不運動胞內寄生菌，可引發(fā)人、畜共患布魯氏桿菌病[1]，致使人與動物不孕、妊娠母體流產(chǎn)，是牛、鹿、羊等動物養(yǎng)殖中危害最大的3種疾病之一[2]。細菌內毒素(Intracellular toxin，LPS)有光滑型和粗造型2種形式。光滑型LPS和宿主細胞MHC-II類分子形成復合物被轉運到細胞表面，干擾巨噬細胞在MHC-II存在的條件下提呈抗原，導致感染的宿主細胞呈遞布魯氏菌抗原特異性CD4+T的能力降低，從而調節(jié)宿主細胞的免疫活性，在感染機制中起著重要作用[3]。感染布魯氏桿菌后產(chǎn)生的血清學反應直接作用于表面的LPS，人類及動物的布魯氏桿菌病的臨床診斷主要檢測抗LPS抗體[4]。本研究對布魯氏桿菌的LPS進行了提取、純化和鑒定，并對其免疫原性進行了測定，為制備布魯氏菌LPS單克隆抗體和布魯氏菌桿菌病的快速診斷方法的建立奠定了研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株M5布魯氏菌桿菌菌株(中國軍事獸醫(yī)研究所疫病室贈送)；BALB/c小鼠(30只，6～8周齡，25.4g左右，吉林大學實驗動物中心)；DNA酶、蛋白酶K(Thermo公司)；蒽酮(Sigma公司)；銀染試劑盒(伯樂生物有限公司)；RNA酶DAB顯色試劑盒(天根生化科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1菌體制備M5菌株經(jīng)布魯氏桿菌活菌苗固體培養(yǎng)基培養(yǎng)復壯，挑取單菌落，接種Brucella Broth液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)48h。菌液革蘭氏染色鑒定。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，離心后，獲得濕菌。生理鹽水洗滌2次，蒸餾水洗滌1次，按1∶3用PBS懸浮菌體(1g濕菌懸浮于3mL PBS)。

1.2.2LPS抗原粗品制備反復凍融菌體懸液3次后，68℃水浴40min，與等量68℃ 90%苯酚混合，68℃水浴中劇烈攪拌30min。冷卻至10℃左右，6 000r/min離心15min，收集上層水相。下層酚相加入等體積68℃超純水，重復提取2次。收集水相，透析袋流水透析48h，超純水透析48h(換液數(shù)次，直至水相用FeCl3檢測無紫色出現(xiàn)為止)，PEG 6 000濃縮4倍，即得LPS粗品。

1.2.3LPS純化粗品LPS中加入10μg/mL RNA酶、10μg/mL DNA酶，37℃孵育40min，加入15μg/mL蛋白酶K，37℃孵育1h，冰浴冷卻，1 500r/min離心20min，收集上清，加入2倍體積無水乙醇，沉淀后，即得純化LPS凍干保存。

1.2.4LPS多糖含量測定蒽酮-硫酸法測定，以葡萄糖為標品制作濃度標準曲線[5]。

1.2.5LPSSDS-PAGE電泳銀染采用5%濃縮膠和12%分離膠垂直板電泳檢測，濃縮膠電壓50V，分離膠電壓80V；銀染試劑盒對凝膠染色并觀察。

1.2.6小鼠免疫及血清抗體效價測定試驗共分3組，每組10只。首次免疫第0天第1組腹腔注射純化LPS(由濃度108個/mL菌液純化所得)乳化液0.5mL/只；第2組腹腔注射全菌乳化液0.5mL/只(菌液濃度108個/mL)；第3組空白對照，腹腔注射蒸餾水。一共5次免疫，2次～5次免疫分別于第7天、第14天、第28天、第42天、第56天進行，方式同首次免疫，但注射液不乳化。5次免疫3d后，摘眼球采血，3 000r/min 10min，取血清備用。

效價測定采用血凝試驗和斑點ELISA檢測血清抗體效價。(包被全菌和純化LPS，封閉液為2%的BSA，10倍梯度稀釋血清，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB試劑盒顯色)。

2 結果與分析

2.1 菌體制備及純化

培養(yǎng)M5菌株的菌液渾濁，革蘭氏染色。普通光學顯微鏡下(100×)觀察呈紅色短桿狀或球狀，確定為布魯氏桿菌(圖1)。

圖1 布魯氏桿菌的革蘭氏染色(100×)

2.2 LPS得率

以葡萄糖含量為橫坐標，OD486nm吸光度為縱坐標，制得標準曲線，回歸方程為：y=0.002 4x-0.002 5(R2=0.998 2)。采用蒽酮-硫酸法測得樣品OD平均值為0.119，LPS的濃度約為67.5μg/mL，得率為0.202%(w/w)(圖2)。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.3 SDS-PAGE銀染鑒定

將3個批次的純化液、蛋白酶K、粗提液經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測。在純化液中得到了30ku左右的條帶，沒有蛋白酶K條帶及其他雜帶；粗提液中除了30ku左右的條帶外，還含有其它雜帶。說明經(jīng)DNA酶、RNA酶、蛋白酶K消化處理之后，去除了粗提液中的雜蛋白，獲得了較純的LPS，與預期結果相同，結果見圖3。

M.蛋白質分子量標準;1.第1批純化LPS;2.第2批純化LPS;3.LPS粗提液;4.第3批純化LPS;5.蛋白酶K

M.Protein Molecular Weight Marker;1.The first batch of purified LPS;2.The second batch of purified LPS;3.Preliminary extraction of LPS;4.The third batch of purified;5.Proteinase K

圖3SDS-PAGE銀染鑒定LPS

Fig.3IdentificationofLPSbySDS-PAGEandSilver-staining

將純化液濃縮，再次進行SDS-PAGE電泳檢測，在28ku～36ku之間出現(xiàn)了清晰的條帶，結果與圖3完全一致，見圖4。

M.蛋白質預染Maker(Fermentas);1、3.陰性對照;2、4.純化LPS濃縮液

M.Plus prestained protein ladder;1,3.Negtive control;2,4.Concentrate Purified LPS

圖4提純的LPS銀染鑒定

Fig.4IdentificationofLPSbySDS-PAGEandSilver-staining

2.4 免疫小鼠血清效價測定

2.4.1血凝試驗檢測血清效價

第2組全菌組凝集價為1∶640，第1組LPS組凝集價略低于1∶640，結果見表1。

表1血凝試驗抗體效價

Table 1 Determination of antibody titer by Hemagglutination Test

注：+.陽性；-.陰性Note:+.indicates positive;-.indicates negative

2.4.2DOT-Elisa檢測抗體血清效價血清被稀至1 000萬倍時，DOT-Elisa檢測仍能顯色，但較為不明顯；稀釋100萬倍時，顯色較為清晰。2組免疫后抗體效價均約為1∶1 000 000，LPS和全菌液免疫原性接近，結果見圖5。

圖5 DOT-ELISA檢測免疫小鼠血清效價

3 小結

在提取菌體脂多糖的過程中，疏水色譜和凝膠過濾雖有優(yōu)越性，但熱酚法因更簡便、快速而被大多數(shù)實驗室采用。本實驗應用熱酚法提取并經(jīng)酶解純化的M5菌株LPS抗原產(chǎn)率可達到0.2%。同時，采用酶解法去除雜蛋白和核酸，因而純度較高(電泳條帶呈1條帶)，去除了雜蛋白和核酸對LPS免疫原性的干擾[6]。經(jīng)免疫后的小鼠，血清效價可達1∶1 000 000，表明純化后的LPS仍有較高的免疫原性。目前，對布魯氏桿菌的研究大多數(shù)都致力于Bp36、Omp31等的克隆表達，而忽略了LPS在布氏桿菌病快速診斷中的作用。應用高純度的LPS制備抗LPS的單克隆抗體，采用ELISA、膠體金等免疫學方法，可建立布魯氏桿菌病快速診斷體系，以實現(xiàn)對布魯氏桿菌病高度特異、靈敏的檢測。

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[4]Weynants V,Gilson D.Characterization of a monoclonal antibody specific for Brucella smooth lipopolysaccharide and development of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay to improve the serological diagnosis of brucellosis[J].Clin Diag Lab Immunol,1996,3(3):309-314.

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