田颯 彭學軍 何宇明 吳蓉

中南大學鐵道學院職工醫(yī)院內科，湖南長沙410075

硫化氫通過調控沉默信息調節(jié)子1抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷

田颯 彭學軍 何宇明 吳蓉

中南大學鐵道學院職工醫(yī)院內科，湖南長沙410075

目的觀察外源性硫化氫（H2S）對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）氧化應激損傷的保護作用及其可能機制。方法用25 mmol/L D-葡萄糖（高糖）、外源性H2S供體硫化氫鈉（NaHS）（5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）及沉默信息調節(jié)子1（SIRT1）特異性抑制劑尼克酰胺（40 mmol/L）處理HUVECs細胞株24 h。實驗分為對照組、高糖組、甘露醇組、NaHS（5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3、5×10-3mol/L）組、高糖+NaHS（5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）組和高糖+NaHS（10-3mol/L）+尼克酰胺組。采用MTT比色法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞內的內活性氧（ROS）水平，Western bolt法檢測SIRT1的表達。結果與對照組比較，高糖組細胞活力顯著降低[OD值分別為（0.76±0.09）和（0.18±0.01），t=5.34，P＜0.05]，細胞內ROS水平顯著增加[ROS水平分別為（356.18± 42.96）au和（1183.63±84.31）au，t=6.72，P＜0.05]。與高糖組比較，高糖+NaHS（5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）組細胞活力顯著增加[OD值分別為（0.18±0.01）、（0.39±0.05）、（0.68±0.04）和（0.51±0.08），t1=3.16，t2=3.95，t3=3.86，均P＜0.05]，細胞內ROS水平顯著降低[ROS水平分別為（1183.63±84.31）、（874.32±85.36）、（628.65±54.27）和（439.56±53.64）au，t1=3.46，t2=3.97，t3=5.13，均P＜0.05]。與對照組比較，高糖組細胞中SIRT1蛋白表達顯著下調[蛋白相對表達量分別為（0.48±0.04）和（0.17±0.03），t=3.94，P＜0.05]。與高糖組比較，高糖+NaHS（10-3mol/L）組細胞中SIRT1表達顯著上調[蛋白相對表達量分別為（0.17±0.03）和（0.59±0.08），t=4.36，P＜0.05]。SIRT1抑制劑尼克酰胺取消了NaHS抑制高糖誘導的HUVECs細胞活力的降低[高糖+NaHS組和高糖+NaHS+尼克酰胺組OD值分別為（0.52±0.04）和（0.23±0.03），t=2.98，P＜0.05]和細胞內ROS水平的增加[高糖+NaHS組和高糖+ NaHS+尼克酰胺組ROS水平分別為（628.65±54.27）au和（1052.84±113.42）au，t=3.76，P＜0.05]。結論外源性H2S抑制了高糖誘導的HUVECs氧化應激損傷，其機制可能與H2S上調SIRT1的表達有關。

硫化氫；高糖；氧化應激；沉默信息調節(jié)子1

糖尿病是常見的代謝障礙性疾病，糖尿病血管病變是糖尿病患者致殘致死的主要原因之一，血管內皮損傷和功能紊亂是糖尿病血管病變的始動環(huán)節(jié)和主要的病理生理學基礎[1]。高血糖是糖尿病血管內皮功能損傷的主要原因，高血糖可直接損傷血管內皮細胞，還可誘導氧化應激損傷血管內皮細胞[2]。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三類氣體信號分子。H2S在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中均有分布，參與了許多重要的生理和病理生理過程[3]。研究報道H2S對血管內皮細胞具有保護作用，H2S也具有較強的抗氧化活性[4]。沉默信息調節(jié)子1（silent information regulation homolog 1，SIRT1）是在真核生物細胞中普遍表達的去乙酰化蛋白，也是一種被稱為“能量感受器”的核轉錄因子[5]。SIRT1可感受機體能量狀態(tài)，如高糖、高脂的改變，調節(jié)其他轉錄因子的表達，也參與了調節(jié)內皮細胞代謝穩(wěn)態(tài)和氧化應激損傷的過程[6]。因此本研究擬采用人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作為研究對象，用硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）作為外源性H2S的供體，觀察外源性H2S對高糖誘導HUVECs氧化應激損傷的保護作用，并從SIRT1的角度探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，批號：14800017），胎牛血清（杭州四季青公司，批號：1401113），NaHS（批號：06315DJ）、胰蛋白酶（批號：H20100116）、D-葡萄糖（批號：026K1516）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號：67-68-5）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，批號：61k5318）、雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃（2′-7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA，批號：4091-99-0）和尼克酰胺（批號：3TP05）均為Sigma公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑（Pierce公司，批號：23225），鼠抗人SIRT1抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗（Santa Cruz公司，批號：sc-47778）。流式細胞測定儀（Beckman公司）和Elx800型酶標儀（Bio-TEK公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)HUVECs細胞株接種于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和2 mmol/L的L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，2～3 d換液。待細胞生長融合至90%后棄去培養(yǎng)液，加入適量0.25%胰蛋白酶消化數(shù)分鐘，吹打分散細胞，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于12孔板，每孔1 mL細胞懸液。

1.2.2 實驗分組取對數(shù)生長期的HUVECs細胞進行實驗，分為對照組：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含5.5 mmol/L葡萄糖；高糖組：含25 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；甘露醇組：含25 mmol/L甘露醇培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；NaHS組：含5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L NaHS培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；高糖+NaHS組：用含5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L NaHS和25 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液共同孵育細胞24 h；尼克酰胺組：用含40 mmol/L SIRT1特異性抑制劑尼克酰胺的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；NaHS+高糖+尼克酰胺組：用含1×10-3mol/L NaHS、25 mmol/L D-葡萄糖和40 mmol/L尼克酰胺的培養(yǎng)液共同孵育細胞24 h。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞增殖細胞胰酶消化后制成懸液，細胞密度為1×104個/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)孔100 μL細胞懸液，每組實驗設3個重復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。在實驗結束前3 h每孔加入100 μL MTT，使MTT的終濃度為0.5 mg/mL，空白對照組不加MTT，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h。吸去全部棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，DMSO結晶完全溶解后，在Elx800型酶標儀上測定波長為570 nm的吸光度值（OD值）。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）采用DCFH-DA作為ROS的捕獲劑，用10 μmol/L DCFH-DA孵育各組細胞30 min，空白對照組不加DCFH-DA。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）漂洗2次，0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，PBS漂洗1次，上機檢測二氯熒光黃的平均熒光強度，以氬離子激光488 nm作為激發(fā)光，每個樣品平均測定10 000個活細胞，以平均熒光強度表示細胞內ROS的水平。

1.2.5 Western blot法檢測SIRT1的蛋白表達采用總蛋白提取試劑盒按說明操作提取細胞總蛋白，BAC法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白質樣本加入2× SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸使蛋白質變性。用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h分離蛋白，將分離的蛋白電轉移至0.22 μm的PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉移效果。5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入鼠抗人SIRT1（1∶500）和β-actin（1∶1000）一抗，4℃孵育過夜。用TBST振搖洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），室溫下孵育2 h，再用TBST振搖洗膜3次。蛋白質印跡熒光檢測試劑盒顯示于X線片，顯影、定影后用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片，用Image lab軟件對條帶進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，對照組與高糖組的比較采用t檢驗，高糖組與NaHS各亞組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖和外源性H2S對HUVECs細胞活力的影響

結果如圖1所示：與對照組比較，高糖組HUVECs的細胞活力顯著降低[OD值分別為（0.76±0.09）和（0.18±0.01），t=5.34，P＜0.05]；而甘露醇組的細胞活力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[OD值分別為（0.76±0.09）和（0.75±0.07），t=0.01，P＞0.05）。與對照組比較，NaHS（5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）組的細胞活力顯著增加[OD值分別為（0.76±0.09）、（0.95±0.14）、（1.14±0.09）和（1.06±0.12），t1=2.93，t2=3.41，t3=3.22，均P＜0.05]，以1×10-3mol/L的NaHS作用最強。與高糖組比較，高糖+NaHS（5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）組細胞活力顯著增加[OD值分別為（0.18±0.01）、（0.39± 0.05）、（0.68±0.04）和（0.51±0.08），t1=3.16，t2=3.95，t3= 3.86，均P＜0.05），以1×10-3mol/L的NaHS作用最強。

圖1 高糖和外源性H2S對人臍靜脈內皮細胞活力的影響

2.2 高糖和外源性H2S對HUVECs細胞內ROS水平的影響

以DCF平均熒光強度反映細胞內ROS水平，結果如圖2所示：與對照組比較，高糖組HUVECs細胞內ROS水平顯著增加[ROS水平分別為（356.18± 42.96）au和（1183.63±84.31）au，t=6.72，P＜0.05），而甘露醇組細胞內ROS水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[ROS水平分別為（356.18±42.96）au和（349.75± 36.15）au，t=0.08，P＞0.05]。與對照組比較，NaHS組（5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）細胞內ROS水平顯著降低[ROS水平分別為（356.18±42.96）、（286.14±24.51）、（218.24±29.64）和（201.35±26.41）au，t1=2.25，t2=2.84，t3=3.17，均P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+NaHS（5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L）組細胞內ROS水平顯著降低[ROS水平分別為（1183.63±84.31）、（874.32±85.36）、（628.65±54.27）和（439.56±53.64）au，t1=3.46，t2=3.97，t3=5.13，均P＜0.05）。

2.3 高糖和外源性H2S對HUVECs細胞內SIRT1表達的影響

圖2 高糖和外源性H2S對人臍靜脈內皮細胞內ROS水平的影響

結果如圖3所示：與對照組比較，高糖組HUVECs細胞中SIRT1表達顯著下調[蛋白相對表達量分別為（0.48±0.04）和（0.17±0.03），t=3.94，P＜0.05），而甘露醇組細胞中SIRT1表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[蛋白相對表達量分別為（0.48±0.04）和（0.47± 0.06），t=0.03，P＞0.05]。與對照組比較，1×10-3mol/L NaHS組細胞中SIRT1表達顯著上調[蛋白相對表達量分別為（0.48±0.04）和（0.86±0.09），t=4.68，P＜0.05]。與高糖組比較，高糖+NaHS（1×10-3mol/L）組HUVECs細胞中SIRT1表達顯著上調[蛋白相對表達量分別為（0.17±0.03）和（0.59±0.08），t=4.36，P＜0.05]。

2.4 SIRT1抑制劑尼克酰胺對H2S作用的影響

圖3 高糖和外源性H2S對人臍靜脈內皮細胞內沉默信息調節(jié)子1表達的影響

結果如圖4所示：SIRT1抑制劑尼克酰胺取消外源性H2S供體NaHS抑制了高糖誘導的HUVECs細胞活力的降低[高糖+NaHS組和高糖+NaHS+尼克酰胺組OD值分別為（0.52±0.04）au和（0.23±0.03）au，t= 2.98，P＜0.05]和高糖誘導的HUVECs細胞內ROS水平的增加[高糖+NaHS組和高糖+NaHS+尼克酰胺組ROS水平分別為（628.65±54.27）au和（1052.84± 113.42）au，t=3.76，均P＜0.05]。

圖4 沉默信息調節(jié)子1抑制劑尼克酰胺對H2S作用的影響

3 討論

高糖可以通過多種途徑損傷內皮細胞和促進內皮細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)高糖通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶依賴性磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）抑制Akt磷酸化，從而促進HUVECs的凋亡[7]。高糖可以增加還原型輔酶Ⅱ氧化酶含量，促進PKC磷酸化，從而增加細胞內ROS的生成，ROS增加又可以活化JNK，從而激活Caspase-3，繼而導致HUVECs的凋亡[8]。因此本研究中用高糖孵育HUVECs誘導損傷，結果顯示25 mmol/L的D-葡萄糖顯著降低了HUVECs的細胞活力，而相同濃度的甘露醇沒有影響HUVECs的細胞活力，這些表明高糖誘導內皮細胞損傷與滲透壓無關。

H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后，發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子。研究表明，H2S具有廣泛的生物學效應，也參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。體內H2S的產(chǎn)生是以L-半胱氨酸為底物，由胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚β合成酶、半胱氨酸轉移酶和3-巰基丙酮酸轉硫酶等催化產(chǎn)生[9]。H2S是一種重要的具有細胞保護作用的物質，對多種細胞具有保護作用[10]。NaHS在溶液中可分離出Na+和HS-，隨后HS-和H+生成H2S，能維持溶液穩(wěn)定的HS-和H+，常作為外源性H2S供體使用。

氧化應激是高糖誘導內皮細胞損傷的重要原因。ROS是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)品，主要包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等，氧化應激時細胞內ROS水平明顯增加[11]。為了探討H2S對高糖誘導HUVECs氧化應激損傷的保護作用，本實驗中用5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3和5×10-3mol/L NaHS和25 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液共同孵育細胞24 h。結果表明，高糖處理HUVECs 24 h后細胞活力明顯降低；NaHS與高糖共同處理顯著增加了HUVECs的細胞活力。這些結果提示NaHS可以拮抗高糖誘導的HUVECs氧化應激損傷。

SIRT1是在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)的第一個sirtuins家族成員，具有去乙?；富钚裕瑢M蛋白、轉錄因子、轉錄共調控因子等在翻譯后具有去乙?；男揎椬饔肹12]。SIRT1是與能量代謝、機體應激反應、細胞衰老和細胞凋亡等密切相關的轉錄因子，是機體重要的能量感受器，被稱為長壽蛋白[13]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在保護血管內皮細胞功能、促進內皮細胞的存活中具有重要作用[14]。陳麗琴等[15]研究顯示SIRT1途徑參與了高糖誘導的炎性反應。Li等[16]的研究發(fā)現(xiàn)H2S通過上調SIRT1的表達抑制了甲醛誘導的內質網(wǎng)應激，這表明H2S能調節(jié)SIRT1的表達。本實驗的結果顯示，高糖組HUVECs細胞中SIRT1表達與對照組比較顯著下調，而NaHS逆轉了高糖誘導的HUVECs細胞中SIRT1表達的下調。SIRT1抑制劑尼克酰胺取消外源性H2S供體NaHS抑制高糖誘導的HUVECs細胞活力的降低和高糖誘導的HUVECs細胞內ROS水平的增加。這些表明外源性H2S抑制了高糖誘導的HUVECs氧化應激損傷，可能與H2S調節(jié)SIRT1的表達有關。

總之，本研究表明外源性H2S抑制了高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷，其機制可能與H2S上調SIRT1的表達有關。本研究為糖尿病血管病變的防治提供了一種新的治療策略和方法。

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Hydrogen sulfide inhibits high glucose-induced oxidative stress injury by modulating silent information regulator 1 in human umbilical vein endothelial cells

TIAN SaPENG XuejunHE YumingWU Rong
Department of Internal Medicine,the Staff-worker Hospital of Railroad Institute of Central South University,Hu＇nan Province,Changsha410075,China

Objective To investigate the protective effect of extrogenous hydrogen sulfide(H2S)on the injury of oxidative stress induced by high glucose and explore the possible mechanism in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were incubated by 25 mmol/L D-glucose(high glucose)to induce injury and cells were treated with H2S donor sodium bisulfide(NaHS)(5×10-5,1×10-4,5×10-4,1×10-3and 5×10-3mol/L)for 24 h.The inhibitor of silent information regulator 1(SIRT1)niacinamide was used in the study.The cells were divided into the control group,high glucose group,mannitol group,NaHS(5×10-5,1×10-4,5×10-4,1×10-3,5×10-3mol/L)groups,high glucose+ NaHS(5×10-5,1×10-4,5×10-4,1×10-3and 5×10-3mol/L)groups and high glucose+NaHS(10-3mol/L)+niacinamide group.MTT assay was used to detect the cell viability.The level of reactive oxygen species(ROS)was measured by flow cytometry.The expression of SIRT1 was tested by Western blot.Results Compared with the control group,the cell viability was significantly decreased[OD were(0.76±0.09)and(0.18±0.01)respectively,t=5.34,P＜0.05],and the level of ROS was significantly increased[the levels of ROS were(356.18±42.96)au and(1183.63±84.31)au respectively,t=6.72,P＜0.05]in high glucose group.Compared with high glucose group,the cells viability were signifi-cantly increased[OD were(0.18±0.01),(0.39±0.05),(0.68±0.04)and(0.51±0.08)respectively,t1=3.16,t2=3.95,t3= 3.86,P＜0.05],and the levels of ROS were significantly decreased[the levels of ROS were(1183.63±84.31),(874.32± 85.36),(628.65±54.27)and(439.56±53.64)au respectively,t1=3.46,t2=3.97,t3=5.13,all P＜0.05]in high glucose+ NaHS(5×10-4,10-3and 5×10-3mol/L)groups.Compared with the control,the expression of SIRT1 was significantly down-regulated in high glucose group[relative expression levels were(0.48±0.04)and(0.17±0.03)respectively,t= 3.94,P＜0.05].Compared with high glucose group,the expression of SIRT1 was significantly up-regulated in high glucose+NaHS(10-3mol/L)group[relative expression levels were(0.17±0.03)and(0.59±0.08)respectively,t=4.36,P＜0.05].Compared with the high glucose+NaHS(10-3mol/L)group,the cell viability was significantly decreased[OD were (0.52±0.04)and(0.23±0.03)respectively,t=2.98,P＜0.05)and the level of ROS was significantly increased[the level of ROS was(628.65±54.27)au and(1052.84±113.42)au,t=3.76,P＜0.05)in high glucose+NaHS(10-3mol/L)+niacinamide group.Conclusion Extrogenous H2S prevents the injury of oxidative stress induced by high glucose in HUVECs, the mechanisms may be related to the up-regulation of SIRT1 induced by H2S.

Hydrogen sulfide;High glucose;Oxidative stress;Silent information regulator 1

R3

A

1673-7210（2014）10（b）-0019-06

2014-07-08本文編輯：程銘）

田颯（1969.6-），女，碩士，主要從事糖尿病并發(fā)癥的防治研究。