趙靜+李玉琴(等)

[摘要] 目的 測(cè)定槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷對(duì)超氧陰離子自由基（O-2·）的清除能力，探討6種化合物清除O-2·的構(gòu)效關(guān)系。 方法 采用流動(dòng)注射鄰苯三酚-魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種化合物對(duì)O-2·的清除率，采用IC50來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。 結(jié)果 槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素對(duì)O-2·的抑制率分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798 μmol/L。6種化合物清除O-2·能力從大到小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素，均高于維生素C（4.9586 μmol/L）。 結(jié)論 6種黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與清除O-2·能力密切相關(guān)：酚羥基是其清除O-2·的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置、數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

[關(guān)鍵詞] 6種黃酮類化合物；超氧陰離子自由基；清除率；構(gòu)效關(guān)系

[中圖分類號(hào)] O657.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）10（b）-0007-05

Study of 6 flavonoids compounds for the scavenging superoxide anion free radical ability and the structure-activity relationships

ZHAO Jing1 LI Yuqin2▲ WANG Fangqiao2 JIA Baoxiu2 LIU Caihong2 WANG Renliang3

1.Taishan Sanatorium of Shandong Province， Shandong Province， Tai'an 271000， China； 2.School of Pharmacy， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China； 3.School of Chemical Engineering， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China

[Abstract] Objective To study the scavenging superoxide anion free radical （O-2·） ability of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and to explore their structure-activity relationships for removing O-2·. Methods The scavenging O-2· ability was determined by flow injection analysis-pyrogallol-chemiluminescence. IC50 was calculated and used to examine the scavenging free radical ability. Vitamin C was used as positive control. Results The results showed that IC50 of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins were 0.1547， 0.2048， 0.4623， 0.6157， 1.8098， 2.9798 μmol/L， respectively. The scavenging O-2· ability of the 6 compounds were arranged as quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and all were higher than Vitamin C （4.9586 μmol/L）. Conclusion The scavenging O-2· ability of 6 flavonoids compounds have been closely related to their structures： phenolic hydroxyl is the necessary group for removing the O-2·， the degree of hydroxylation， the number and location of hydroxyl of B ring， the hydroxyl and double bond of the formatting of C ring opening， substituent position， number and spatial structure of A ring， are all important influencing factors of antioxidant activity.

[Key words] Six flavonoids compounds； Superoxide anion free radical； The scavenging ability； The Structure-activity relationships

生物體在自身的新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，超氧陰離子自由基（O-2·）是具有代表性的活性氧自由基之一。研究表明，許多疾病，如癌癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病、代謝失調(diào)、光損傷、毒物侵害等都與人體內(nèi)的自由基有關(guān)。O-2·的破壞作用是通過(guò)一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)的，可引發(fā)組織的不斷氧化消耗，其結(jié)果是破壞性和不可逆轉(zhuǎn)的，只能通過(guò)加入抗氧化劑終止鏈反應(yīng)。因此，尋找能夠清除活性氧自由基的抗氧化劑具有十分重要的意義。

眾多研究表明，天然黃酮類化合物有抗突變、抗腫瘤、抗炎、治療心血管疾病等廣泛生物學(xué)活性，其中最為重要的是它能減少自由基的形成和清除自由基[1-5]。然而黃酮類化合物種類繁多，其清除自由基的功效與每種化合物的具體結(jié)構(gòu)有關(guān)，因而不同的物質(zhì)可能對(duì)不同體系的抗氧化作用不同，對(duì)不同類型的自由基和組織也存在選擇性作用[6-10]。了解黃酮類化合物抗氧化、清除自由基的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)于通過(guò)化學(xué)修飾的方法有效改變黃酮類化合物現(xiàn)有結(jié)構(gòu)弱點(diǎn)，增強(qiáng)其生物學(xué)活性，增大其實(shí)用價(jià)值有重要意義。

筆者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷6種黃酮化合物對(duì)O-2·的清除能力，探討6種化合物抗氧化作用的構(gòu)效關(guān)系。

1 儀器與試藥

MPI-B型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（西安瑞邁分析儀器有限公司），自動(dòng)電位滴定儀ZD-2型。槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；鄰苯三酚、無(wú)水碳酸鈉、碳酸氫鈉（天津市博迪化工有限公司）；魯米諾（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

魯米諾儲(chǔ)備液（1.0×10-2 mol/L）：稱取適量魯米諾，用0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶，冰箱中儲(chǔ)存。

維生素C溶液（1.0×10-2 mol/L）：稱取適量維生素C用水溶解，并定容至100 mL容量瓶中。

槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷儲(chǔ)備液（1.0×10-2 μg/mL）：用50%乙醇配制。

鄰苯三酚（0.01 mol/L）：用0.01 mol/L HCl配成儲(chǔ)備液，使用前用水稀釋。

Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（0.01 mol/L）：臨用前新鮮配制。

2.2 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法

實(shí)驗(yàn)管路見圖1。蠕動(dòng)泵分別泵入鄰苯三酚溶液S、魯米諾-碳酸鹽緩沖液C和空白或被測(cè)物R，在反應(yīng)器中混合并反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。

P：蠕動(dòng)泵；V：換向閥；F：檢測(cè)器；W：廢液；PTM：光電倍增管；HV：負(fù)高壓；PC：記錄儀

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀示意圖

2.3 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)程序編寫

為了使體系發(fā)光穩(wěn)定且發(fā)光較強(qiáng)，將增益設(shè)為3，高壓為600 V。為了減少泵管的損耗，將主泵速度設(shè)為30 r/min，副泵速度設(shè)為30 r/min。試驗(yàn)程序見表1。

表1 超氧陰離子自由基試驗(yàn)程序

注：L：左，R：右；Y：是；F：向前

2.4 O-2·檢測(cè)體系的優(yōu)化

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生O-2·，O-2·與魯米諾發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)電子激發(fā)態(tài)的中間物，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，反應(yīng)體系中O-2·的量可以間接地用化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I來(lái)表示[11]。以發(fā)光的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及強(qiáng)度為依據(jù)分別考察緩沖液pH、鄰苯三酚和魯米諾濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。當(dāng)緩沖液pH=10，鄰苯三酚和魯米諾濃度分別為0.005、0.06 mmol/L時(shí)，體系的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及發(fā)光強(qiáng)度最佳。見圖2。

2.5 抗氧化測(cè)定及抑制率計(jì)算

在最佳條件下，分別測(cè)定空白溶液的發(fā)光強(qiáng)度（I0）和一系列加入樣品溶液后體系的發(fā)光強(qiáng)度（IT）。根據(jù)發(fā)光信號(hào)的降低值（I0-IT），可定量分析6種化合物與維生素C清除O-2·的能力，可計(jì)算出加入不同濃度溶液后抑制發(fā)光的程度，即對(duì)自由基的抑制率：

抑制率=（I0-IT）/I0×100%

以發(fā)光抑制率為縱坐標(biāo)，樣品液濃度為橫坐標(biāo)，繪出發(fā)光抑制率曲線，并計(jì)算出發(fā)光抑制率為50%時(shí)的濃度IC50，用來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)。每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。

2.6 6種化合物對(duì)O-2·的清除能力

測(cè)定不同濃度槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C溶液對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，O-2·的清除率，計(jì)算發(fā)光抑制率，并繪制發(fā)光抑制率曲線。見圖3。

1.槲皮素；2.根皮苷；3.楊梅素；4.柚皮苷；5.葛根素；6.原花青素；7.維生素C

圖3 6種化合物和維生素C對(duì)O-2·的清除作用

由圖3可知，6種黃酮類化合物和維生素C溶液對(duì)O-2·的清除效果均呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，即隨著溶液濃度的增大，其對(duì)O-2·的清除效果也增強(qiáng)。槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素 6種化合物和維生素C溶液對(duì)O-2·的清除率IC50值分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798、4.9586 μmol/L。提示對(duì)O-2·的清除能力大小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素、維生素C。

3 討論

3.1 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)

黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的一類物質(zhì)，兩個(gè)芳環(huán)（A、B環(huán)）之間以一個(gè)三碳鏈相連，具有C6-C3-C6基本構(gòu)型，將三個(gè)環(huán)分別標(biāo)為A、B、C（圖4）。其母核上帶有羥基、甲氧基、羥氧基等取代基分別形成各種黃酮類化合物，以游離苷原或以與糖結(jié)合的苷類等形式存在于許多植物中。黃酮類各環(huán)上的羥基活性相差較大：B環(huán)的酚羥基活性最高；當(dāng)C環(huán)上羥基和不飽和雙鍵相連時(shí)，C環(huán)也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，A環(huán)的酚羥基活性最弱。

3.2 B環(huán)與抗氧化性

B環(huán)上的羥基化程度是抗氧化活性的一個(gè)主要因素，含鄰位酚羥基黃酮類化合物與自由基反應(yīng)形成了較為穩(wěn)定的共軛半醌式自由基，從而中斷游離自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所以具有較強(qiáng)的抗氧化性。B環(huán)中的鄰二酚羥基對(duì)黃酮類化合物的抗氧化活性起主要作用，具有強(qiáng)抗氧化活性的這類物質(zhì)一般都有3′，4′-鄰苯二酚結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素和楊梅素具有3′，4′-鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，它們?cè)?種化合物中抗氧化活性較強(qiáng)。羥基的位置和數(shù)目與抗氧化活也有密切的關(guān)系，羥基數(shù)目和位置的差異，使化合物表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)IC50值表明，槲皮素抗氧化活性遠(yuǎn)大于楊梅素，故可推測(cè)楊梅素B環(huán)5′位羥基抑制其抗氧化活性。

3.3 C環(huán)與抗氧化性

黃酮化合物C環(huán)的3位羥基是很重要的結(jié)構(gòu)，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發(fā)生異構(gòu)化，變成二酮式，此結(jié)構(gòu)在二位上產(chǎn)生具有較高活性的-CH-基團(tuán)，不飽和C環(huán)延長(zhǎng)了A、B環(huán)的共軛體系，使苯氧自由基更加穩(wěn)定，增強(qiáng)了抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、楊梅素具有此結(jié)構(gòu)，因此兩者具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)比較根皮苷和柚皮苷的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根皮苷C環(huán)開環(huán)且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮苷的抗氧化活性遠(yuǎn)大于柚皮苷，因此推測(cè)C環(huán)的開環(huán)結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認(rèn)為，7位氧糖苷對(duì)活性不利，C環(huán)開環(huán)結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環(huán)與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環(huán)的羥基大多處在C5和C7，不像B環(huán)那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過(guò)去認(rèn)為，A環(huán)不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應(yīng)，但近來(lái)研究表明，A環(huán)也可發(fā)揮抗氧化作用[13]。同時(shí)，A環(huán)上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中葛根素只有7位羥基，沒(méi)有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實(shí)驗(yàn)表明，7位羥基在4′羥基存在時(shí)可以提高抗氧化活性[14]，本實(shí)驗(yàn)所研究的化合物均具有這種結(jié)構(gòu)，IC50值表明它們的抗氧化活性均強(qiáng)于維生素C，故均具有很強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環(huán)上2′位多了一個(gè)多羥基環(huán)氧化物，故可推測(cè)A環(huán)上的取代基會(huì)影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結(jié)構(gòu)與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)影響了抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測(cè)定，操作簡(jiǎn)單和重現(xiàn)性好，可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結(jié)果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛(wèi) 軻）

3.3 C環(huán)與抗氧化性

黃酮化合物C環(huán)的3位羥基是很重要的結(jié)構(gòu)，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發(fā)生異構(gòu)化，變成二酮式，此結(jié)構(gòu)在二位上產(chǎn)生具有較高活性的-CH-基團(tuán)，不飽和C環(huán)延長(zhǎng)了A、B環(huán)的共軛體系，使苯氧自由基更加穩(wěn)定，增強(qiáng)了抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、楊梅素具有此結(jié)構(gòu)，因此兩者具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)比較根皮苷和柚皮苷的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根皮苷C環(huán)開環(huán)且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮苷的抗氧化活性遠(yuǎn)大于柚皮苷，因此推測(cè)C環(huán)的開環(huán)結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認(rèn)為，7位氧糖苷對(duì)活性不利，C環(huán)開環(huán)結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環(huán)與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環(huán)的羥基大多處在C5和C7，不像B環(huán)那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過(guò)去認(rèn)為，A環(huán)不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應(yīng)，但近來(lái)研究表明，A環(huán)也可發(fā)揮抗氧化作用[13]。同時(shí)，A環(huán)上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中葛根素只有7位羥基，沒(méi)有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實(shí)驗(yàn)表明，7位羥基在4′羥基存在時(shí)可以提高抗氧化活性[14]，本實(shí)驗(yàn)所研究的化合物均具有這種結(jié)構(gòu)，IC50值表明它們的抗氧化活性均強(qiáng)于維生素C，故均具有很強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環(huán)上2′位多了一個(gè)多羥基環(huán)氧化物，故可推測(cè)A環(huán)上的取代基會(huì)影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結(jié)構(gòu)與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)影響了抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測(cè)定，操作簡(jiǎn)單和重現(xiàn)性好，可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結(jié)果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛(wèi) 軻）

3.3 C環(huán)與抗氧化性

黃酮化合物C環(huán)的3位羥基是很重要的結(jié)構(gòu)，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發(fā)生異構(gòu)化，變成二酮式，此結(jié)構(gòu)在二位上產(chǎn)生具有較高活性的-CH-基團(tuán)，不飽和C環(huán)延長(zhǎng)了A、B環(huán)的共軛體系，使苯氧自由基更加穩(wěn)定，增強(qiáng)了抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、楊梅素具有此結(jié)構(gòu)，因此兩者具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)比較根皮苷和柚皮苷的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根皮苷C環(huán)開環(huán)且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮苷的抗氧化活性遠(yuǎn)大于柚皮苷，因此推測(cè)C環(huán)的開環(huán)結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認(rèn)為，7位氧糖苷對(duì)活性不利，C環(huán)開環(huán)結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環(huán)與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環(huán)的羥基大多處在C5和C7，不像B環(huán)那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過(guò)去認(rèn)為，A環(huán)不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應(yīng)，但近來(lái)研究表明，A環(huán)也可發(fā)揮抗氧化作用[13]。同時(shí)，A環(huán)上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中葛根素只有7位羥基，沒(méi)有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實(shí)驗(yàn)表明，7位羥基在4′羥基存在時(shí)可以提高抗氧化活性[14]，本實(shí)驗(yàn)所研究的化合物均具有這種結(jié)構(gòu)，IC50值表明它們的抗氧化活性均強(qiáng)于維生素C，故均具有很強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環(huán)上2′位多了一個(gè)多羥基環(huán)氧化物，故可推測(cè)A環(huán)上的取代基會(huì)影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結(jié)構(gòu)與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)影響了抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測(cè)定，操作簡(jiǎn)單和重現(xiàn)性好，可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結(jié)果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團(tuán)，B環(huán)的羥基化程度、羥基的數(shù)目和位置，C環(huán)開環(huán)后形成的羥基和雙鍵，A環(huán)取代基的位置數(shù)目以及化合物的空間結(jié)構(gòu)，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛(wèi) 軻）