趙超悅，宋潤(rùn)敏，秦 暉，王 娜，楊 柳，李 江

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院膜通道實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130024）

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）又稱CD147，其高表達(dá)在腫瘤中較為常見(jiàn)。近幾年來(lái)EMMPRIN是腫瘤領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。EMMPRIN在多種正常上皮細(xì)胞表達(dá)，但其表達(dá)水平較低；而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高，例如在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá)［1－4］。EMMPRIN表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，其高表達(dá)能夠反應(yīng)出腫瘤的惡性進(jìn)展和高死亡率，并能預(yù)測(cè)其不良預(yù)后。EMMPRIN作為膜蛋白是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的重要誘導(dǎo)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)MMP水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。然而，EMMPRIN與腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系尚不清楚，EMMPRIN是否影響腫瘤細(xì)胞的增殖／凋亡信號(hào)需要深入研究。EMMPRIN作為一種在機(jī)體中廣泛存在的跨膜糖蛋白，其生物學(xué)功能的發(fā)揮很大程度依賴于與蛋白質(zhì)相連接的糖鏈，不同的糖基化形式賦予其不同的生物學(xué)功能，尤其表現(xiàn)在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞表面糖基化異常與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，這些變化包括糖鏈結(jié)構(gòu)在表達(dá)水平上的差異以及特殊糖鏈結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。但尚無(wú)針對(duì)EMMRPIN糖基化位點(diǎn)突變的相關(guān)報(bào)道，本研究主要針對(duì)EMMPRIN預(yù)測(cè)的3個(gè)糖基化位點(diǎn)構(gòu)建單點(diǎn)突變質(zhì)粒，研究其糖基化位點(diǎn)突變后對(duì)EMMPRIN蛋白穩(wěn)定性和功能方面的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、主要試劑和儀器 EMMPRIN／GFP質(zhì)粒由華盛頓大學(xué)Dr.Pushparsky設(shè)計(jì)［7］并惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α和人胚胎腎臟細(xì)胞HEK293T由東北師范大學(xué)遺傳所提供；細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、ExTag DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pronega公司；EMMPRIN多抗體購(gòu)自SanTa CRUZ Biotechnology公司，產(chǎn)品貨號(hào)為SC－13976。Bioer TC－96／T／H（a）基因擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司，LX－100手掌型離心機(jī)購(gòu)自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，XW－80A旋渦混合器購(gòu)自上海精科實(shí)業(yè)有限公司，JY 200C電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，電子天平購(gòu)自梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 采用Megaprimer PCR技術(shù)，根據(jù)EMMPRIN／GFP序列和突變位點(diǎn)自行設(shè)計(jì)3組6條引物，EMMPRIN序列中第44、152和186位設(shè)計(jì)的引物序列分別為第44位：上游引物5′－TCCTTGCAGGACAGCGCCACAGAG－3′，下游引物5′－GCTGTCCTGCAAGGAGCAGGTGAG－3′；第152位：上游引物5′－CTCATGCAGGGCTCCGAGAGCAGG－3′，下游引物5′－GGAGCCCTGCATGAGGGCCTTGTC－3′；第186位：上游引物5′－CGGTGCCAGGGCACCAGCTCCAAG－3′，下游引物5′－GGTGCCCTGGCACCGGTACTGGCC－3′，其中下劃線為引入突變氨基酸的密碼子。PCR反應(yīng)：采用50μL體系，10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，dNTP（2.5mmol·L－1）4μL，模板（0.5mg·L－1）2μL，ddH2O 36μL，最后加Ex Tag DNA聚合酶（2.5U·μL－1）1μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1min；95℃變性40s，60℃退火1min，68℃延伸10min；72℃延伸、補(bǔ)全10min；循環(huán)數(shù)：12個(gè)。DpnⅠ消化：DpnⅠ消化PCR產(chǎn)物，酶切體系DpnⅠ（10U·μL－1）1μL，10×DpnⅠ反應(yīng)緩沖液5μL，PCR產(chǎn)物44μL，37℃保溫1h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，取5μL DpnⅠ消化PCR產(chǎn)物，加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，輕輕混合，冰浴30min，42℃熱休克90s，再冰浴2min，最后全部涂布于氨芐青霉素抗性LB平板（氨芐青霉素濃度為1000mg·L－1），37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3 提取質(zhì)粒、酶切鑒定及測(cè)序 挑取單菌落，堿法提取質(zhì)粒，用BamHⅠ行酶切鑒定，10μL酶切體系：BamHⅠ1μL，10×反應(yīng)緩沖液1μL，待鑒定質(zhì)粒5μL，ddH2O 3μL，37℃保溫2h，選擇酶切鑒定確認(rèn)誘變成功的質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞可傳代培養(yǎng)，完全培養(yǎng)液為DMEM＋10%（體積比）新生牛血清＋青霉素，每3d換液1次，5～6d傳代1次。

1.5 Western blotting法檢測(cè)EMMPRIN蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解后經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)束后，聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）在100%甲醇中浸泡30s以上、重蒸餾水浸泡1min，取出后放入電轉(zhuǎn)緩沖液中。凝膠與PVDF膜一起按照電轉(zhuǎn)儀裝置說(shuō)明書(shū)要求安裝，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入電泳槽中，加電轉(zhuǎn)液，在100V電壓下轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST配制的5%（W／V）的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1h。然后加入用脫脂奶粉稀釋的一抗，4℃下孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。以HRP標(biāo)記二抗室溫下孵育，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。在暗室中曝光，顯影，定影。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以20%～30%的密度鋪到12孔板中，將其培養(yǎng)于37℃、95%濕度和5%CO2孵箱中，將提取的純度較高的質(zhì)粒用OPTI－MEM轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。48h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 HEK293T細(xì)胞以4×10－3／孔的密度接種到96孔板（每孔100μL培養(yǎng)基），設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，37℃、5%CO2溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，每種轉(zhuǎn)染設(shè)6個(gè)平行孔。37℃、5%CO2溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。24、48、72和96h后分別加入MTT溶液（5g·L－1）10μL，37℃、5%CO2溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，4h后每孔再加150μL DMSO，在酶標(biāo)儀上490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）值。A值可間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，用以檢測(cè)細(xì)胞活性。對(duì)照組細(xì)胞生存率為100%，其余各組細(xì)胞生存率＝（各實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值）×100%，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞存活率以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 酶切鑒定 構(gòu)建3個(gè)糖基化單點(diǎn)突變質(zhì)粒EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）后，酶切鑒定其是否突變成功，結(jié)果顯示：BamHⅠ單酶切后，糖基化單點(diǎn)突變質(zhì)粒不破壞酶切位點(diǎn)，野生型與突變型均得到7500和800bp的片段。酶切結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 EMMPRIN突變型BamHⅠ酶切鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of identification of mutant－type EMMPRIN digested by BamHⅠ

2.2 測(cè)序鑒定 測(cè)序結(jié)果顯示：第44位天冬酰胺（AAT）突變成谷氨酰胺（CAG），第152位天冬酰胺（AAC）突變成谷氨酰胺（CAG），第186位天冬酰胺（AAC）突變成谷氨酰胺（CAG），成功構(gòu)建EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）糖基化位點(diǎn)突變質(zhì)粒，證實(shí)突變成功。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2（插頁(yè)四）。

2.3 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將EMMPRIN以及其3個(gè)糖基化位點(diǎn)突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中，檢測(cè)EMMPRIN蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：EMMPRIN糖基化位點(diǎn)突變后，EMMPRIN蛋白的對(duì)應(yīng)位置不能糖基化，只表現(xiàn)為非糖基化形式。見(jiàn)圖3。

圖3 EMMPRIN野生型與突變型蛋白的表達(dá)Fig.3 Expressions of wild－type and mutant－type EMMPRIN proteins

2.4 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 將EMMPRIN及其糖基化突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)突變后的重組質(zhì)粒均可在細(xì)胞中表達(dá)，EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞核分裂相顯著減少，偽足數(shù)目減少，胞漿外有一些顆粒滯留。見(jiàn)圖4（插頁(yè)五）。

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 野生型細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；而EMMPRIN糖基化位點(diǎn)突變后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）細(xì)胞存活率均顯著低于野生型（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 EMMPRIN野生型與突變型不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

表1 EMMPRIN野生型與突變型不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

＊P＜0.05compared with vector；△P＜0.05compared with wild－type EMMPRIN.

Plasmid±4.515297.017±11.258 Wild type EMMPRIN 112.664±7.364＊132.709±7.385＊204.684±5.100＊339.433±12.229＊EMMPRIN（N44Q）89.465±0.263△101.116±2.668△160.879±1.283△288.349±14.131△EMMPRIN（N152Q）75.112±3.372△84.364±2.319△129.655±0.597△251.268±1.992△EMMPRIN（N186Q）65.399±3.127△68.047±1.272△102.075±0.623△195.535±2.87724487296 Vector 100.000±0.586114.223±1.857173.729 Survival rate（t／h）△

3 討 論

EMMPRIN是一種跨膜糖蛋白，并具有酪氨酸蛋白激酶活性，屬于免疫球蛋白超家族，參與細(xì)胞間的識(shí)別。EMMPRIN在體內(nèi)分布非常廣泛，Chen等［8］觀察高鈣培養(yǎng)和EMMPRIN抗體對(duì)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分化相關(guān)形態(tài)學(xué)，認(rèn)為EMMPRIN是一種新的低分化角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)志蛋白，并可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。EMMPRIN在多種正常上皮細(xì)胞表達(dá)，但表達(dá)水平較低［9］。EMMPRIN的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，其高表達(dá)代表腫瘤的惡性進(jìn)展和高死亡率，并預(yù)測(cè)不良預(yù)后［10－11］。EMMPRIN的超表達(dá)還與腫瘤耐藥性和腫瘤根治術(shù)后的復(fù)發(fā)密切相關(guān)［12］；所以EMMPRIN是診斷腫瘤和預(yù)后檢測(cè)的標(biāo)志物。EMMPRIN有3個(gè)預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)，分別是44、152和186位的天冬酰胺。本研究通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將3個(gè)天冬酰胺分別突變成谷氨酰胺，構(gòu)建N44Q、N152Q和N186Q單點(diǎn)突變EMMPRIN質(zhì)粒，研究EMMPRIN的糖基化位點(diǎn)與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)性。

EMMPRIN是一種高度糖基化的糖蛋白，其糖基化程度對(duì)蛋白穩(wěn)定性和功能方面具有重要的影響。EMMPRIN糖基化與其生物學(xué)功能的發(fā)揮密切相關(guān)，在不同轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞中EMMPRIN的糖基化形式及糖鏈結(jié)構(gòu)不盡相同，腫瘤細(xì)胞表面糖基化異常與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有密切關(guān)系。將突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中使其表達(dá)蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)：3個(gè)糖基化位點(diǎn)單點(diǎn)突變后，EMMPRIN蛋白不能糖基化，只表現(xiàn)為非糖基化形式，說(shuō)明突變后的EMMPRIN蛋白失去了糖基化的修飾作用；同時(shí)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖基化位點(diǎn)突變后，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞核分裂相減少，偽足生成數(shù)減少，胞漿外顆粒滯留，可能是糖基化位點(diǎn)突變后，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)無(wú)法上膜，不能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。本研究揭示EMMPRIN的去糖基化可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開(kāi)關(guān)，但信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如何被開(kāi)啟，尚需要深入研究。

蛋白質(zhì)糖基化的分子機(jī)制對(duì)于癌癥等重大疾病的研究具有相當(dāng)重要的指導(dǎo)意義，已成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。EMMRPIN表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，MTT結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：野生型細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組；而EMMPRIN糖基化位點(diǎn)突變后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）細(xì)胞存活率均顯著低于野生型。EMMPRIN突變型可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且隨作用時(shí)間增加，其抑制作用減弱，EMMPRIN糖基化修飾與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果為深入研究EMMPRIN在腫瘤細(xì)胞中如何發(fā)揮作用及其糖基化與腫瘤的何種信號(hào)通路相關(guān)提供了線索和依據(jù)。

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