丁小維

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

0 引 言

耐(嗜)鹽真菌是能夠在鹽濃度為0.2 mol/L以上環(huán)境中生長(zhǎng)的真菌，主要分布在鹽湖、鹽田、海洋等高鹽環(huán)境中。目前，對(duì)耐(嗜)鹽真菌的研究主要集中在海洋環(huán)境耐(嗜)鹽真菌物種多樣性及其代謝產(chǎn)活性物質(zhì)方面[1-3]，而對(duì)植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌的研究相對(duì)較少。鈕旭光等[4]從遼寧雙臺(tái)子國(guó)家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)陸鹽堿地及潮間帶生長(zhǎng)的翅堿蓬(Suaedasalsa)中分離到13個(gè)屬的內(nèi)生真菌。在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)的耐鹽植物組織中可能蘊(yùn)藏著豐富的耐鹽內(nèi)生真菌。此外，研究證實(shí)高鹽地區(qū)植物內(nèi)生真菌對(duì)宿主適應(yīng)鹽逆境方面發(fā)揮重要作用[5-7]。因此，研究?jī)?nèi)陸極端鹽湖區(qū)植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌可為耐鹽植物的培育及促進(jìn)鹽堿化土壤的綜合利用提供豐富的菌種資源。

花馬鹽湖屬于堿性碳酸鹽型內(nèi)陸高鹽湖泊，位于陜西省榆林定邊縣城西北10 km處的鹽場(chǎng)堡鄉(xiāng)?；R鹽湖蘊(yùn)藏著非常豐富的碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣等資源。該鹽湖區(qū)寒暑變化劇烈，年降水量小(年降水約為316.9 mm)，日照強(qiáng)烈，蒸發(fā)量大(年蒸發(fā)量高達(dá)2 490 mm)，干燥及輻射強(qiáng)烈，因此具有高鹽堿、大溫差、高寒、高熱、干燥及強(qiáng)輻射等極端環(huán)境特征。鹽湖區(qū)沉積物Na+濃度從46.7 g/kg到飽和Na+濃度，生長(zhǎng)于湖岸的鹽蒿其組織中Na+含量為普通植物6倍多，該地區(qū)無疑是發(fā)掘極端耐(嗜)鹽真菌多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。

本文利用不同含鹽培養(yǎng)基分離純化花馬鹽湖區(qū)耐鹽植物鹽蒿的耐(嗜)鹽真菌，基于形態(tài)學(xué)和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系認(rèn)識(shí)真菌物種多樣性，豐富我國(guó)鹽湖真菌菌種資源，為耐(嗜)鹽真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽蒿(A.halodendron)采自陜北榆林定邊縣北鹽堡鄉(xiāng)花馬鹽湖區(qū)(海拔1 301 m，緯度37°40′478N，經(jīng)度107°30′724E)。新鮮的植物材料收集于塑料袋中，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于分離耐(嗜)鹽真菌。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)改良馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(cPDA)：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，維生素B110 mg/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然；(2)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：麥芽提取物20 g/L，蛋白胨1 g/L，葡萄糖15 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6；(3)酵母膏葡萄糖蛋白胨(YPD)：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然。在上述3種分離培養(yǎng)基中分別添加濃度為2.5%，5%，10%和15%的NaCl。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

主要儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(E600型，日本尼康公司)，熒光倒置顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯IX71/IX81)，冷凍超速離心機(jī)(Beckman)，PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)，電泳儀(Bio-Rad)，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)及DNA測(cè)序儀(ABI PRISM 377)等。

1.2 方法

1.2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離純化

將鹽蒿莖、葉組織置于自來水下沖洗4～5 h后，在無菌條件下依次用有效氯含量為4.5%～5%的次氯酸鈉(含0.01% Tween 80)處理3 min，用75%乙醇處理15 s，最后用無菌水清洗6次。將表面消毒徹底的植物材料切成0.5 cm2小塊，并置于分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1～3 w，挑取菌絲接入含5% NaCl的YPD斜面純化培養(yǎng)，純化斜面于4 ℃保藏備用。

1.2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

采用形態(tài)學(xué)并結(jié)合ITS系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。菌落培養(yǎng)特征、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子特征參照魏景超主編的《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[8]。采用CTAB法[9]提取鹽蒿內(nèi)生真菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：超純無菌水9 μL，2×PCR Mix 11 μL，10 μmol/L的ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各2 μL，基因組DNA約50 ng；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃ 擴(kuò)增1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再保持10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列提交GenBank，并下載相似性高的數(shù)據(jù)，用Clustal-X[10]軟件對(duì)所得序列文件進(jìn)行比對(duì)分析，通過Mega 4.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離

利用cPDA、YPG及MEA培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生真菌，從表面消毒的莖、葉組織塊中共分離到1 215株真菌，以YPG上獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)最多，占35.5%，而在cPDA和MEA上分離到的菌株數(shù)較YPG的少。培養(yǎng)基不同鹽濃度對(duì)內(nèi)生真菌分離研究表明，以含鹽濃度為15%的NaCl培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多(404株)，含5%NaCl的培養(yǎng)基次之(340株)，分別占其出菌總數(shù)的33.3%和28%。

2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

2.2.1 耐(嗜)鹽真菌的形態(tài)學(xué)

形態(tài)學(xué)研究表明，不同形態(tài)種的菌落特征正反面形態(tài)及顏色差異很大(圖1，表1)，如AH-1菌落較圓整平鋪，正面粉紅色，反面內(nèi)側(cè)淺灰黑色，外側(cè)粉紅色，菌絲較粗壯、發(fā)達(dá)，分枝有隔(圖1A,C)；AH-18菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭，反面黃色，菌絲分枝有隔，分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子，大小2.0 μm×2.0 μm(圖1B,D)；AH-35菌落正面黃綠色，反面黃褐色，分生孢子球形或近球形，大小2.5 μm×2.5 μm，(2.0～2.5)μm×(2.5～4.75)μm?；诰浜惋@微形態(tài)特征，從鹽蒿中獲得的內(nèi)生真菌屬于9個(gè)不同的形態(tài)種，以AH-1為優(yōu)勢(shì)種，其分離頻率為78.8%，其余菌株分離頻率在0.09%～2.1%之間(表1)。

圖1 鹽蒿部分耐(嗜)鹽真菌菌落及顯微形態(tài)特征

菌株編號(hào)分離頻率/%形態(tài)學(xué)特征(菌絲、孢子大小/μm)ITS/%GenBank中最相似種及其登錄號(hào)分類地位AH-178.8菌落較圓整,正面粉紅色,反面產(chǎn)脂溶性黑色素;菌絲(5.0～8.75)粗壯、發(fā)達(dá),分枝有隔,且局部膨大;菌絲內(nèi)生孢子呈圓形,大小(2.25～2.5)×(2.25～2.5)99/97Pleosporales sp.HQ914837Leptosphaeria sp.AH-20.2菌落圓整,正面內(nèi)側(cè)淺灰色,外側(cè)青綠色,反面淺黃色;菌絲分枝有隔;產(chǎn)生帚狀枝,分生孢子呈球形99Penicillium chrysogenum,JQ015265PenicilliumchrysogenumAH-40.7菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形99Trichoderma longibrachiatum,HQ882796Trichoderma sp.AH-180.09菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭,反面黃色;菌絲分枝有隔,分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子,大小2.0×2.0100Aspergillus westerdijkiae,JN793950Aspergillus westerdijkiaeAH-200.09菌落較圓整平鋪,正面粉紅色,反面內(nèi)側(cè)淺灰黑色,外側(cè)粉紅色;菌絲較粗壯、發(fā)達(dá),分枝有隔;未見產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria sp.AH-222.1菌落呈褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有縱橫隔100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria tenuissimaAH-290.09菌落呈灰褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有3～5個(gè)縱橫隔,孢子大小(10～15)×(30～36)100Alternaria alternata,JQ070079Alternaria alternataAH-340.2菌落正反面淺粉色,棉絮狀;菌絲有隔分枝;未見分生孢子99Fusarium chlamydosporum,HQ671187Fusarium sp.AH-350.09菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形,大小2.5×2.5,(2.0～2.5)×(2.5～4.75)99/100Trichoderma longibrachiatum,JQ653055Trichoderma longibrachiatum

2.2.2 ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析

鹽蒿內(nèi)生真菌ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，8個(gè)代表菌株(AH-2，AH-4，AH-18，AH-20，AH-22，AH-29，AH-34及AH-35)的ITS序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中序列相似性≥99%，聚于系統(tǒng)發(fā)育樹分枝上的步長(zhǎng)值在74%～100%之間。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，上述菌株屬于Penicillium、Trichoderma、Aspergillus、Alternaria及Fusarium，被鑒定為Penicilliumchrysogenum、Aspergilluswesterdijkiae、Alternariatenuissima和Trichodermalongibrachiatum等。菌株AH-1，AH-32，AH-58，AH-64和AH-77同GenBank數(shù)據(jù)庫中格孢菌目(Pleosporales)一真菌的ITS序列相似性為97%，上述菌株內(nèi)聚于一個(gè)分枝上，步長(zhǎng)值分別為99%?；谛螒B(tài)學(xué)特征，上述5個(gè)菌株為L(zhǎng)eptosphaeria屬的一潛在新物種。Leptosphaeria是花馬鹽湖鹽蒿內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬，其次為Alternaria，分別占78.8%和2.28%。研究結(jié)果表明，陜北花馬鹽湖堿蓬中蘊(yùn)藏著較豐富的耐(嗜)鹽真菌。上述真菌的ITS序列提交GenBank登錄號(hào)為：KC460798，KC460799，KC460801，KC460814，KC460816，KC460818，KC460825，KC460828，KC460830，KC460831，KC460858和KC460871。

圖2 鹽蒿內(nèi)生真菌ITS鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討 論

研究了通過含鹽濃度不同的cPDA、MEA及YPG培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)真菌并研究物種多樣性。從鹽蒿莖、葉組織中共分離到1 215株真菌，在YPG上獲得的內(nèi)生菌株數(shù)最多，以含NaCl濃度為15%的培養(yǎng)基出菌率最高。楊麗源等[12]分離耐(嗜)鹽真菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽礦水樣中的真菌在以5%NaCl的YPG培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多，某些固體樣則以含5%或15%的NaCl培養(yǎng)基為最佳。由于樣品類型差異，為獲得鹽蒿中多樣的耐(嗜)鹽真菌，分離培養(yǎng)基的鹽濃度需要多樣化。

近年來，形態(tài)學(xué)和ITS序列分析被廣泛應(yīng)用于真菌物種多樣性研究[13-15]。由于ITS序列長(zhǎng)度合適，具有較高的種間變異和低種內(nèi)變異及其在GenBank，EMBL/ENA及DDBJ等國(guó)際數(shù)據(jù)庫中有大量參考序列，被認(rèn)為是真菌鑒定的理想分子標(biāo)簽[16-17]。本研究從花馬鹽湖鹽蒿中獲得6個(gè)真菌屬，Leptosphaeria為優(yōu)勢(shì)屬，獲得9個(gè)形態(tài)種如P.chrysogenum、A.westerdijkiae、Al.tenuissima和T.longibrachiatum等。鈕旭光等[4]從翅堿蓬根、莖及葉組織中獲得49株的內(nèi)生真菌，以Glomerella、Alternaria、Colletotrichum和Cladosporium為優(yōu)勢(shì)菌屬。雖然不同生境中的鹽蒿內(nèi)生真菌群落豐富度存在一定相似性，但在某些種屬分布存在差異性，這可能由于某些內(nèi)生真菌具有宿主特異性，且其分布受宿主所生長(zhǎng)的環(huán)境影響。本研究探討鹽湖鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌物種多樣性，將為耐(嗜)鹽真菌的開發(fā)利用提供菌種資源。

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