陳淵，王偉，涂明，吳哲褒，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

siRNA靶向沉默成纖維細胞激活蛋白α對膠質瘤細胞U87增殖的影響

陳淵，王偉，涂明，吳哲褒，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

目的：探討小分子干擾RNA（siRNA）靶向沉默成纖維細胞激活蛋白α（FAP-α）表達對神經(jīng)膠質瘤細胞株U87增殖的影響。方法：實驗分為空白對照組（Blank組）、陰性對照組（NC組）和siRNA組，通過脂質體將siRNA轉染至膠質瘤細胞株U87，使用Western blot法檢測FAP-α基因的蛋白水平，同時檢測NC組和siRNA組Bcl-2、caspase-3的表達變化，使用Real-time PCR法檢測FAP-α和增殖核抗原（PCNA）的mRNA水平，CCK-8法評價轉染后NC組和siRNA組細胞的增殖能力。結果：①轉染48 h后，siRNA組細胞FAP-αmRNA、蛋白的表達明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），siRNA組較NC組caspase-3蛋白表達增加（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.01），siRNA組較NC組PCNA mRNA表達明顯下降（P＜0.01）。②轉染后48、72和96 h siRNA組U87細胞吸光度值低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：應用siRNA沉默F(xiàn)AP-α基因的表達，可以抑制膠質瘤細胞U87的增殖，誘導膠質瘤細胞的凋亡。

神經(jīng)膠質瘤；小分子干擾RNA；成纖維細胞激活蛋白α；細胞增殖

神經(jīng)膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其生長快，生存率極低，目前的治療方法難以取得滿意的療效[1-2]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞激活蛋白α（fibroblast activation protein alpha，F(xiàn)AP-α）選擇性表達于90%以上惡性上皮性腫瘤，在腫瘤的生長、增殖、侵襲和轉移中發(fā)揮重要的作用[3]。目前關于FAP-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中研究較少，特別是膠質瘤，關于其在膠質瘤中的作用尚未有明確的結論，本實驗擬通過脂質體將小分子干擾RNA（siRNA）轉染至膠質瘤細胞株U87，靶向沉默F(xiàn)AP-α的表達，來探討其對U87細胞增殖的影響，為膠質瘤的基因治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料人神經(jīng)膠質瘤細胞株U87由吳哲褒教授饋贈，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM購自美國Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；SYBR Green Real time PCR Master Mix-Plus購自TOYOBO公司；CCK-8試劑盒購自DOJINDO公司；FAP-α抗體購自Abgent公司；caspase-3、Bcl-2購自CST公司；GAPDH、辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ig-G（H+L）購自Bioworld公司；siRNA序列為：5’-GGUGGAUUCUUUGUUUCAATT-3’，5’-UUGAAACAAAGAA UCCACCTT-3’；陰性對照非特異性RNA序列為：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’，均由上海吉瑪公司合成；相應PCR引物設計見表1。

表1 基因的引物序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染：U87細胞用含有10%血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。將U87細胞分為3組，分別為空白對照組（Blank組）、陰性對照組（NC組）和siRNA組。接種于培養(yǎng)板，待生長融合至70%～80%時用Lipofectamine 2000進行轉染，具體步驟按說明書操作。

1.2.2 Real-time PCR實驗：將轉染后48 h各組細胞分別用Trizol法提取總RNA，反轉錄合成cDNA，進行Real-time PCR。反應條件：95 ℃，3 min，一個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環(huán)。每個標準模板均生物學重復3次，目的基因的mRNA相對表達水平用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=［Ct目的基因（待測樣品）-Ct內(nèi)參照（待測樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參照（校正樣品）］。

1.2.3 Western blot實驗：各組細胞轉染48 h后分別提取總蛋白，BCA法蛋白測定。SDS-PAGE電泳后，電轉儀將蛋白轉移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉2 h后，加入相應一抗，抗體稀釋度為GAPDH（1:5 000）、FAP-α（1:1 000）、Bcl-2（1:1 000）、caspase-3（1:1 000），4 ℃孵育過夜，加入相應二抗，室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光試劑盒顯影。用Gel-Pro軟件分析，以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對定量。實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8實驗：將轉染的細胞以合適的密度接種于96孔板，實驗分為2組：NC組和siRNA組，每組設5個復孔，另設置5個調零孔，轉染后時間設置為0 h，分別在24、48、72和96 h采用CCK-8檢測細胞增殖能力，具體操作步驟按說明書進行。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件。定量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染后U87膠質瘤細胞FAP-αmRNA和蛋白的表達轉染Blank組、NC組和siRNA組FAP-αmRNA表達分別為：1.01±0.17、0.87±0.17、和0.14 ±0.01，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），轉染siRNA組FAP-αmRNA表達水平明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。轉染Blank組、NC組和siRNA組FAP-α蛋白表達分別為：0.74±0.01、0.73±0.04、和0.21± 0.05，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），轉染siRNA組FAP-α蛋白表達水平明顯低于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果與Real-time PCR一致，見圖1。

圖1 轉染后U87細胞FAP-α蛋白和mRNA表達變化

2.2 轉染后U87細胞增殖的變化與NC組比較，轉染后24、48、72和96 h siRNA組吸光度值（OD450值）降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；轉染后24 h二者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 轉染后U87細胞增殖的變化

2.3 轉染后U87細胞Bcl-2、caspase-3和PCNA的表達Western blot法檢測Bcl-2、caspase-3蛋白的表達，結果顯示：siRNA組較NC組caspase-3蛋白表達增加（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。Real-time PCR檢測PCNA的表達結果顯示：siRNA組較NC組PCNA mRNA表達明顯下降（P＜0.01），見圖3。

3 討論

FAP-α是一種具有761個氨基酸的I I型穿膜糖蛋白[4]，基因定位于染色體2q23[5]，與多種疾病有關，包括創(chuàng)口愈合、慢性炎癥和腫瘤等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)AP-α的高表達與腫瘤的高危轉移、低存活率、復發(fā)和極差預后密切相關[6-8]，但具體的機制仍不明確。Huang等[9]用建立了表達FAP-α的小鼠乳腺腫瘤移植模型,發(fā)現(xiàn)該模型腫瘤生長速度遠遠快于對照組，提示FAP-α具有促進腫瘤生長的作用。溫秋婷等[10]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)FAP能夠促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移。同樣的，朱琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)FAP在體外可促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖遷移和小管形成，提示其在腫瘤血管生成起到一定的作用。

圖3 轉染后Bcl-2、caspase-3蛋白和PCNA mRNA表達情況

神經(jīng)膠質瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤，治療手段有限，預后極差?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)FAP-α在正常腦組織中低表達或不表達，在星形細胞癌中，F(xiàn)AP-α的表達是與WHO分級相關的[12]，病理級別越高，F(xiàn)AP-α表達越強并與膠質瘤的侵襲性有關[13]。目前關于FAP-α與神經(jīng)膠質瘤增殖的研究報道尚少。本實驗研究沉默F(xiàn)AP-α的表達對膠質瘤細胞株U87增殖的影響，我們用脂質體轉染siRNA，沉默F(xiàn)AP-α的表達，運用Real-time PCR和Western Blot法檢測轉染后靶基因的表達變化，證實與對照組比較，實驗組FAP-α基因的mRNA和蛋白水平均有明顯的下降。

研究發(fā)現(xiàn)，PCNA與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映腫瘤細胞增殖狀態(tài)的良好指標[14]，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15]。我們通過Real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)轉染后siRNA組較NC組PCNA表達明顯下降，隨著靶基因的表達下調而下降。提示實驗組細胞增殖能力的下降。同樣的，CCK-8實驗結果顯示，實驗組細胞的細胞增殖能力均分別低于相應對照組，并且隨時間的延長而差距變大。由此說明有效的沉默F(xiàn)AP-α的表達，可以促進膠質細胞瘤的生長增殖能力下降，并增加和促進其凋亡。

凋亡是細胞程序性自殺的過程，誘導腫瘤細胞的凋亡能抑制細胞增殖，是目前抗腫瘤的一種潛在的方法[16]。Bcl-2是抑制細胞凋亡的原癌基因，可以穩(wěn)定線粒體電位，抑制CytC釋放來抑制凋亡的線粒體依賴途徑，其異常的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系[17]。caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的caspase成員中引起細胞凋亡的關鍵性激酶，也是細胞凋亡的主要參與成分。caspase級聯(lián)反應在凋亡通路中處于重要地位，尤其caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié)[18]。本研究中細胞轉染48 h后發(fā)現(xiàn)，下調FAP-α的表達可以顯著抑制Bcl-2蛋白水平并上調caspase-3表達，說明下調FAP-α的表達能誘導U87細胞凋亡。綜上所述，通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)FAP-α的表達下調能夠使膠質瘤細胞的增殖能力下降，促進凋亡發(fā)生。因此FAP-α有可能成為臨床治療膠質瘤的靶點。但本研究僅以神經(jīng)膠質瘤細胞U87為研究對象，探討下調表達FAP-α對U87細胞的影響，關于在其他膠質瘤細胞株和體內(nèi)實驗的情況，以及在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展和診療中的作用機制研究仍不清楚，還需進一步的研究。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of siRNA on proliferation of glioma cell line U87 by targeting fibroblast activation protein alpha

CHEN Yuan, WANG Wei, TU Ming, WU Zhebao, ZHENG Weiming.Department of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To explore the effect of small interfering RNA (siRNA) -mediated fibroblast activation protein alpha knock-down on proliferation of glioma cell line U87.Methods:The experiment is divided into Blank, NC and siRNA. Negative control or siRNA were transfected into U87cells by Lipofectamine 2000. After transfection, protein level of target gene FAP-α, Bcl-2 and caspase-3 were detected by Western blot, mRNA level of PCNA and FAP-αwere detected by Real-time PCR. The proliferation ability of NC group and siRNA group of cells were analyzed by CCK8 assay.Results:①Forty-eighth after transfection, mRNA and protein expressions of FAP-α in siRNA group were remarkably reduced as compared with those in NC and Blank group (P<0.05); Compared with NC group, the expression of caspase-3 was higher (P<0.05), while that of Bcl-2 was lower (P<0.01). The expression of PCNA mRNA was lower than NC group (P<0.01). ②The OD450 value of siRNA group was significantly lower than that in the NC group 24, 48, 72 and 96 h after transfection (P<0.05). Conclusion: siRNA-mediated fibroblast activation protein alpha knock-down can inhibit the proliferation of U87 glioma cells and promote apoptosis of glioma cells.

glioma; small interfering RNA; fibroblast activation protein alpha; cell proliferation function

R739.41

A

1000-2138（2014）04-0241-04

2013-10-28

浙江省外科學重中之重學科開放基金資助項目（kfjj2011006）。

陳淵（1988-），男，浙江臺州人，碩士生。

鄭偉明，主任醫(yī)師，碩士生導師，Email：zhwm61@ 126.com。