王 君 曲 群

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710000；2.西安交通大學(xué)二附院婦產(chǎn)科，陜西西安 710000

YAP和CREB蛋白在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

王 君1曲 群2

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710000；2.西安交通大學(xué)二附院婦產(chǎn)科，陜西西安 710000

目的探討YAP及CREB蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況及其意義。方法 采用免疫組化檢測(cè)2008年1月—2013年12月收治的93例患者，觀察20例正常卵巢組織、20例良性卵巢腫瘤及53例上皮性卵巢癌組織中YAP、CREB蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果YAP在上皮性卵巢癌組織中陽性表達(dá)率為90.57%，而在正常卵巢組織及卵巢良性上皮性腫瘤僅為50%、65%。CREB蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況(77.36%)也高于正常卵巢組織(5%)，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論YAP、CREB蛋白可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，YAP、CREB在上皮性卵巢癌中的異常表達(dá)可為上皮性卵巢癌的診斷、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

卵巢癌；上皮性腫瘤；YAP；CREB；免疫組化

卵巢癌是常見的婦科生殖器官惡性腫瘤之一，因其部位較深，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病例也缺乏有效的治療手段，5年生存率僅為15%～30%[1]，故而嚴(yán)重的威脅著婦女的健康及生命，該實(shí)驗(yàn)對(duì)該院2008年1月—2013年12月病理科存檔的蠟塊93例進(jìn)行研究，探討YAP和CREB蛋白在正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤及卵巢上皮性癌中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)的差異性及卵巢上皮性癌臨床病理因素間的關(guān)系以及兩者間的相關(guān)性，探討其在卵巢上皮性惡性腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制以及它們之間的相關(guān)關(guān)系，從而有助于為卵巢上皮性惡性腫瘤的早期診斷提供新的分子生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)為臨床治療途徑提供一些思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科存檔的蠟塊93例，其中20例為正常卵巢組織，20例良性上皮性卵巢腫瘤，53例卵巢上皮性癌，其中卵巢上皮性癌患者年齡37～68歲，中位數(shù)為56歲，采用免疫組化（SP）法檢測(cè)YAP和CREB蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)的差異性及與惡性卵巢上皮性腫瘤臨床病理因素的關(guān)系，同時(shí)探討其二者間的相關(guān)性。所有患者術(shù)前均未接受放、化學(xué)或免疫治療，所有標(biāo)本均經(jīng)該院病理科確診。

1.2 標(biāo)本的處理

組織標(biāo)本均用磷酸緩沖液配置的10%中性甲醛固定液及時(shí)固定后，進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明以及石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

（1）兔抗人YAP多克隆均抗體購自美國CST公司，兔抗人CREB多克隆均抗體購自美國CST公司，PBS（0.001M，PH7.4）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,按試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，以公司提供的陽性片染色作為陽性對(duì)照。（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：①根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分，陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②染色強(qiáng)度計(jì)分以細(xì)胞顯色反應(yīng)程度計(jì)分：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；③將陽性細(xì)胞所占的百分比分值和染色強(qiáng)度分值相乘為結(jié)果：0分為陰性 (-)，l～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。以購買的陽性片免疫組化染色結(jié)果為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)生閱片，取其平均值為最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。χ2檢驗(yàn)用于計(jì)數(shù)資料的比較分析，YAP和CREB的相關(guān)分析用Spearman等級(jí)分析法。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP、CREB在不同卵巢組織中的表達(dá)

在實(shí)驗(yàn)中，YAP在正常卵巢組織陽性表達(dá)率為50%,YAP在良性上皮卵巢腫瘤的陽性表達(dá)率為65%，在惡性上皮性卵巢腫瘤中陽性表達(dá)率為90.57%，CREB在正常卵巢組織陽性表達(dá)率為5%,在良性上皮卵巢腫瘤的陽性表達(dá)率為25%，在惡性上皮性卵巢腫瘤中陽性表達(dá)率為77.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表1。

表1 YAP、CREB在三種組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 YAP、CREB表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系

YAP的陽性表達(dá)在正常卵巢組織與良性卵巢上皮性腫瘤之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，YAP在組織學(xué)中低分化 (G3)組中的陽性表達(dá)(97.1%)與高中分化(GI-G2)組的表達(dá)(77.8%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（χ2=5.217，P=0.040）；但 YAP在上皮性卵巢癌陽性表達(dá)與患者年齡、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在正常卵巢組織與良性卵巢上皮性腫瘤之間CREB的陽性表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CREB在組織學(xué)中低分化(G3)組中的陽性表達(dá)(85.7%)與高中分化(GI-G2)組的表達(dá)(61.1%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（χ2=9.382，P=0.001）；CREB在上皮性卵巢癌淋巴轉(zhuǎn)移中陽性率(77.4%)較I-Ⅱ期(69.2%)有升高趨勢(shì)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(χ2=5.568，P=0.015)。另外，CREB的陽性表達(dá)與患者年齡、臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 YAP和CREB二者表達(dá)的相關(guān)性分析

該研究顯示在正常在卵巢上皮細(xì)胞中，YAP和CREB陽性表達(dá)率分別為50%和50%，在卵巢上皮性癌組織中YAP和CREB陽性表達(dá)率分別為90.75%和77.36，經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌組織中的YAP和CREB表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（r=0.442，P=0.001＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因索、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。正常情況下。細(xì)胞增生與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡維持著組織器官正常大小和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往關(guān)聯(lián)于細(xì)胞發(fā)生異常增殖或凋亡抑制。Hippo信號(hào)通路是一種維持增生與凋亡間平衡的信號(hào)通路，YAP蛋白是Hippo信號(hào)通路中一個(gè)起中心作用的蛋白，在細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中，YAP作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子通過其PPXY結(jié)構(gòu)域可與轉(zhuǎn)錄因子TEAD家族，P73，SMAD家族(BMP通路)，Bric2，Bnc5(IAP家族)，ErbB4胞質(zhì)結(jié)合域，PEBP2a等結(jié)合[2]促進(jìn)Hippo下游目的基因的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)YAP基因存在于與多種人類腫瘤相關(guān)的染色體1lq22上，因此YAP基因是一種原癌基因[3]。Angela A等[4]采用免疫組化方法檢測(cè)了YAP在12例正常卵巢組織及42例卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP在漿液性囊腺癌組中的陽性率(98%)顯著高于在正常卵巢上皮細(xì)胞的陽性率(50%)，提示YAP的過量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增生及凋亡的失衡，直接或間接地參與漿液性囊腺癌的發(fā)生。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同上述結(jié)果，并與組織分期有關(guān)，提示YAP與卵巢上皮性癌的發(fā)生有密切關(guān)系。

表2 YAP與CREB在不同停卵巢上皮性組織中表達(dá)的相關(guān)性[n（%）]

CREB，即cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，于80年代后期被發(fā)現(xiàn)，是PKA重要的下游轉(zhuǎn)錄因子。它具有調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、生理節(jié)奏、細(xì)胞的發(fā)育與生存、成癮性和抑郁以及學(xué)習(xí)記憶等功能[5]。多項(xiàng)研究表明，由CREB參與調(diào)控的靶基因在細(xì)胞增殖、分化、存活和細(xì)胞周期的調(diào)控中起重要作用。其過表達(dá)能促使細(xì)胞存活和增殖，在多種腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[6-9]。CREB表達(dá)水平及磷酸化程度在卵巢上皮細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的生存中也具有重要作用[10]，卵泡刺激素和黃體生成素至少部分是通過cAMP細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢的功能。與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。該實(shí)驗(yàn)中，CREB與卵巢上皮性癌的組織學(xué)分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CREB可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后起一定作用。

綜上所述，YAP和CREB可能是卵巢癌發(fā)生的致癌因素，且都在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，二者在卵巢癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，隨著腫瘤治療技術(shù)水平分飛速發(fā)展，目前致癌基因的研究由單一基因發(fā)展到對(duì)多個(gè)基因協(xié)同作用和相互調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。癌基因的靶向治療為臨床婦科惡性腫瘤的診斷及治療開辟一條新的途徑，在將來，YAP與CREB可能成為用于早期篩查惡性腫瘤的最新分子標(biāo)志物，從而為研發(fā)新的抗腫瘤藥物提供新的思路。

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Expression and Clinical Significance of YAP and CREB Protein in Epithelial Ovarian Cancer

WANG Jun1QU Qun2
1.Xi'an Jiaotong University Heath Science Center,Xi'an,Shaanxi Province,710000,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an,Shaanxi Province,710000,China

Objective To observe the expression of YAP and CREB protein and its significance in epithelial ovarian carcinoma. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of YAP and CREB protein in 20 cases of normal ovarian tissues,20 cases of benign ovarian tumor tissues and 53 cases of epithelial ovarian carcinoma tissues.Results The positive expression rate of YAP was 90.57%in epithelial ovarian carcinoma tissues,while it was only 50%,65%in the normal ovarian tissues and benign ovarian epithelial tumor tissues,respectively.The positive expression rate of CREB protein in epithelial ovarian cancer tissues(77.36%)was higher than that in the normal ovarian tissues(5%),the difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).Conclusion YAP and CREB protein may be closely related to the occurrence and development of epithelial ovarian cancer.The abnormal expression of YAP and CREB in epithelial ovarian cancer can provide an experimental evidence for the diagnosis and treatment of epithelial ovarian cancer.

Ovarian cancer;Epithelial tumors;YAP;CREB;Immunohistochemistry

R737.31

A

1674-0742（2014）12（b）－0033-03

王君（1977-），女，遼寧大連人，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科。