朱加銀，王賢親，朱仔花，胡盧豐，陳錫文

（溫州醫(yī)科大學1．實驗動物中心，2．藥學院，3．附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州 325035）

肝硬化模型大鼠CYP2B6和CYP3A酶活性變化

朱加銀1，王賢親2，朱仔花2，胡盧豐3，陳錫文1

（溫州醫(yī)科大學1．實驗動物中心，2．藥學院，3．附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州 325035）

目的研究CYP2B6和CYP3A酶活性在肝硬化模型大鼠體內(nèi)的變化。方法雄性SD大鼠分別采用每周2次ip給予30%CCl4連續(xù)7周、飲用含0．03%～0．04%硫代乙酰胺（TAA）液連續(xù)10周、復合法（sc給予用花生油配制的40%CCl4＋高脂飼料＋15%乙醇，共6周）及免疫法（sc給予牛血清白蛋白20～40 mg·kg－1，共11周）制備肝硬化模型后，聯(lián)合ig給予安非他酮15 mg·kg－1和咪達唑侖10 mg·kg－1。測定給藥前及給藥后0．083，0．25，0．5，1，1．5，2，2．5，3，4，6，8，12和24 h的血藥濃度。結果與正常對照組相比，四氯化碳組和TAA組的2個探針藥曲線下面積（AUC）均顯著性升高（P＜0．05），峰濃度cmax顯著性升高（P＜0．01），清除率Cl／F均顯著性下降（P＜0．05）；復合法組2個探針藥cmax均顯著性下降（P＜0．05）；免疫組2個探針藥的藥代參數(shù)均無統(tǒng)計學意義。結論CCl4和TAA誘導的肝硬化模型大鼠體內(nèi)CYP2B6和CYP3A酶活性降低。

探針藥；肝硬化；藥代動力學；細胞色素P450 CYP2B6；細胞色素P450 CYP3A

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．013

肝硬化是一種肝細胞彌漫性變性壞死并伴有結節(jié)形成、肝纖維化呈廣泛性特點的慢性疾病。肝纖維化是各種損傷因子持續(xù)作用而引起的損失修復反應，以肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）活化增殖為中心環(huán)節(jié)，使主要為膠原纖維的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）大量沉積，促使肝細胞大量凋亡，膽管內(nèi)皮細胞（bile duct endothelial ce lls，BEC）異常增生，并破壞正常的肝結構與功能，從而最終發(fā)展成為肝硬化［1］。

肝是藥物體內(nèi)代謝的重要器官，而細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）是參與藥物Ⅰ相代謝反應的主要超家族酶系。CYP是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，分布在多個器官、組織，與內(nèi)外源性的物質(zhì)代謝密切相關［2－3］。因而通過評價肝硬化模型大鼠體內(nèi)CYP活性，對合理用藥治療肝病具有潛在意義。以往研究表明，肝損傷大鼠CYP3A基因表達減弱［4］；CYP2B基因表達增強［5］；肝硬化時大鼠的肝微粒體CYP總量明顯降低［6］。目前尚未見從CYP方面評價肝硬化模型大鼠，并對其體內(nèi)CYP2B6和CYP3A酶活性變化的報道。本研究通過4種不同因素誘導大鼠肝硬化模型，以探針藥安非他酮（amfebutamone）和咪達唑侖（midazolam）的體內(nèi)代謝情況探討肝硬化大鼠體內(nèi)CYP2B6和CYP3A酶活性的變化。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑及儀器

四氯化碳（CCl4），購自西隴化工股份有限公司，批號：1111012，硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA），國藥集團化學試劑有限公司，批號：20111128、牛血清白蛋白（bovine serum album in，BSA）與石蠟油，購自上海生工生物工程有限公司，批號：分別為RS0327B2012J與SJ0222S7512J）、咪達唑侖、安非他酮與阿托品，購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為171250-200401，100671-201001與100040-200510）、咪達唑侖注射液；購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20100108，色譜純甲醇與乙腈，購自德國Merck公司；其余試劑為分析純。Bruker Esquire系列HCT質(zhì)譜儀，德國Bruker公司產(chǎn)品、Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品。

1．2 動物

SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量220～240 g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（浙）2010-0044。實驗與飼養(yǎng)條件嚴格按照SPF級動物實驗室標準操作規(guī)程（SOP）規(guī)范操作，動物使用許可證號：SYXK（浙）2010-0150。

1．3 模型制備、分組與給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組（n＝10）：正常對照組、四氯化碳組（CC l4）、TAA組、復合法組及免疫組。CC l4組：ip給予30%CC l4石蠟油2 m L·kg－1，每周2次，連續(xù)7周。TAA組：蒸餾水稀釋TAA，前5周含飲0．03%TAA水，后5周飲0．04%TAA水，共10周。復合法組：每3 d ip給予40%CCl4花生油。首次5 m L·kg－1，以后3 m L·kg－1，同時飼喂高脂飼料，15%乙醇飲水，連續(xù)6周。免疫組：生理鹽水稀釋BSA，第1，15，25，35天同劑量皮下2～3個點注射BSA，20 mg·kg－1，間隔10 d，再每周2次，第1次和第3次40 m g·kg－1，其余每次20 m g·kg－1，共9次。正常對照組：給予相應的生理鹽水。造模結束后尾靜脈采血測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT），禁食12 h聯(lián)合ig給予安非他酮15 mg·kg－1和咪達唑侖10 mg·kg－1并測定血藥濃度。

1．4 肝組織病理形態(tài)檢測、肝微粒體制備

實驗結束時，麻醉安樂處死大鼠，開腹取肝，用濾紙吸干水分，稱重計算肝系數(shù)〔肝質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）×100〕后，切取小塊肝組織置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成6μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)的改變。其余肝液氮速凍后于－80℃保存以制備肝微粒體。采用差速離心法制備微粒體。在4℃以下環(huán)境中，每10 g肝，加蔗糖PBS緩沖液25 m L勻漿后再超聲分散30 s。勻漿液8 944×g、上清液、吸取上清液894 400×g分別離心15，15，90 m in后，棄去上清液，沉淀再用PBS緩沖液10 m L復溶，保存于－80℃?zhèn)溆?。用BCA法定量，測定肝微粒體蛋白濃度。

1．5 血樣采集與處理

探針藥給予前及給藥后的0．083，0．25，0．5，1，1．5，2，2．5，3，4，6，8，12和24 h取大鼠尾靜脈0．3 m L置于肝素化試管中，2 236×g離心5 m in，分離血漿，－40℃保存待測。精密取血漿100μL，加入內(nèi)標阿托品（0．2 m g·L－1）10μL，混勻，再加入乙腈-甲醇（90∶10，V／V）混合溶液200μL，渦旋0．5 m in，15 115×g離心10 m in后，取上清液200μL于自動進樣器的樣品瓶中，設定10μL進樣檢測。

1．6 檢測條件

Zorbax SB-C18（2．1 mm×150 mm，5μm），流速0．4 m L·m in－1，柱溫30℃，A（0．1%甲酸），B（乙腈）；0～4 m in，10%～85%B；4～8 m in，85%～85%B；8～9 m in，85%～10%B；9～10 m in，10%～10%B。ESI（電噴霧離子源），霧化氣（N2）壓力30 psi，干燥氣（N2）的流速7 L·m in－1、溫度350℃。選擇正離子方式檢測，檢測電壓3．5 kV，采用選擇離子監(jiān)測（SIM）方式進行定量。安非他酮、咪達唑侖和內(nèi)標阿托品的分子離子峰［M＋H］＋分別為m／z 240．2，326．3和290．2。

1．7 血漿標準曲線及準確度與精密度的測定

取空白血漿100μL，共9份，精密加入不同量的2種探針藥物，使血漿中安非他酮和咪達唑侖的濃度分別為5，10，20，50，100，200，500，1000，2000μg·L－1，按1．5項處理血漿樣品。用大鼠空白血漿配制安非他酮和咪達唑侖10，200和1600μg·L－1質(zhì)控樣品，每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，計算準確度與精密度。

1．8 藥代動力學參數(shù)的測定

測定大鼠單次ig給予安非他酮15 mg·kg－1和咪達唑侖10 mg·kg－1后0．083，0．25，0．5，1，1．5，2，2．5，3，4，6，8，12和24 h血漿中安非他酮和咪達唑侖的平均血藥濃度-時間曲線，計算藥代動力學參數(shù)。

1．9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2．1 肝硬化大鼠的體質(zhì)量、肝系數(shù)、GPT和肝微粒體蛋白含量

由表1可見，與正常對照組相比，除TAA組體質(zhì)量明顯降低外（P＜0．01），其余3組均無明顯變化；4個模型組的肝系數(shù)均顯著升高（P＜0．05），GPT均顯著性升高（P＜0．01）；肝微粒體蛋白含量均顯著降低（P＜0．05）。

2．2 肝硬化大鼠肝組織形態(tài)表現(xiàn)

肉眼見模型組大鼠肝變形，質(zhì)地變硬，色澤暗淡，表面肉眼可見彌漫分布大小不等的結節(jié)樣增生，直徑0．1～0．3 cm，最大者直徑不超過0．7 cm，邊緣較薄，被膜增厚切面彌漫性圓形或類圓形結節(jié)，纖維間隔較薄且均勻。由圖1可見，正常對照組大鼠光鏡下可見正常肝小葉結構完整，細胞排列整齊，網(wǎng)狀結構完整，胞漿均勻（圖1A）；模型組大鼠大多可見明顯假小葉，肝細胞水腫，脂肪樣變性，甚至壞死，炎癥細胞浸潤，纖維化程度嚴重。CCl4組與復合法組大鼠肝組織均輕度肝硬化，正常肝小葉結構破壞或消失，被假小葉所取代，假小葉呈圓形或類圓形，部分假小葉由幾個不完整的肝小葉構成，內(nèi)含≥2個中央靜脈或1個偏在邊緣部的中央靜脈（圖1B，D）；TAA組大鼠肝組織重度肝硬化，伴自溶，假小葉呈圓形或卵圓形，中央靜脈缺如，匯管區(qū)可包繞在假小葉內(nèi)，肝細胞索和血竇的排列紊亂，分布極不規(guī)則（圖1C）；免疫組大鼠肝組織輕度肝硬化，假小葉內(nèi)肝細胞水腫變性，脂肪浸潤（圖1E）。

Tab．1 Body mass，liver index，glutamic-pyriuvic transaminase（GPT）and microsomes content in liver of rats with liver cirrhosis

Fig．1 Pathological changes of liver tissue of rats with liver cirrhosis（HE×400）．See Tab．1 for the rat treatments．A：NC group；B：CC l4group；C：TAA group；D：CM group；E：IM group．Arrow s show hepatic fibrosis and pseudolobuli．

2．3 肝硬化大鼠體內(nèi)CYP2B6和CYP3A對藥物藥代動力學的影響

2．3．1 色譜行為

由圖2可見，安非他酮、咪達唑侖和內(nèi)標阿托品的色譜峰保留時間分別在5．0，5．4和4．4 m in左右，藥物與內(nèi)標分離良好，不受血漿內(nèi)源物質(zhì)干擾，基線平穩(wěn)，本方法具有一定的專屬性和特異性。

Fig．2 Chromatograms of midazolam and amfebutamone in rat plasma by LC-MS．A：blank plasma sample；B：blank plasma sample spiked with midazolam 500μg·L－1，amfebutamone 500μg·L－1and IS 200μg·L－1；C：plasma sample from a rat1 h after oral administration of amfebutamone 15 mg·kg－1and midazolam 10 mg·kg－1．All analysis was performed with a 1200 Series liquid chromatograph and a Bruker Esquire HCT mass spectrometer equipped with an electrospray ion source．Chromatographic separation was achieved on a 150 mm×2．1 mm，5μm particle，Agilent Zorbax SB-C18 column at30℃．The mobile phase was water（containing 0．1%formic acid）and acetonitrile in a gradient mode．The flow rate was 0．4 m L·m in－1．Peak 1：atropine；peak 2：midazolam；peak 3：amfebutamone．

2．3．2 標準曲線

以探針藥的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標（Y），以探針藥的質(zhì)量濃度與內(nèi)標質(zhì)量濃度比為橫坐標（X），權重因子為1／X2，進行線性回歸，得安非他酮和咪達唑侖的標準曲線回歸方程分別為Y＝0．0017X＋0．0251（r＝0．9998）；Y＝0．0025X＋0．0835（r＝0．9992），最低定量下線均為5μg·L－1。

2．3．3 準確度與精密度

由表2可見，安非他酮和咪達唑侖的準確度在92．50%～111．88%之間，日內(nèi)精密度均＜8．53%，日間精密度均＜8．94%，方法的準確度和精密度均符合生物樣品血藥濃度分析的要求。

2．3．4 回收率、基質(zhì)效應和穩(wěn)定性

分別用空白血漿和空白基質(zhì)配制安非他酮和咪達唑侖10，200和1600μg·L－1的質(zhì)控樣品，每個濃度進行5樣本分析，根據(jù)基質(zhì)加入前后和樣品提取前后質(zhì)譜信號響應的色譜峰面積比，計算基質(zhì)效應與提取回收率。結果表明，基質(zhì)效應均在90%～110%之間，提取回收率均＞86．67%。

分別考察安非他酮和咪達唑侖10，200和1600μg·L－1的質(zhì)控樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性，結果表明其在室溫放置12 h、預處理后室溫放置24 h、反復凍融3次和－40℃冰箱內(nèi)冷凍保存14 d，血漿樣品測定結果穩(wěn)定。

2．3．5 藥動學參數(shù)

圖3和表3結果顯示，4種不同因素誘導大鼠肝硬化模型后，與正常對照組相比，CCl4組和TAA組的2個探針藥AUC均顯著性升高（P＜0．05），清除率Cl／F均顯著性下降（P＜0．05），cmax顯著性升高（P＜0．01），V／F降低（P＞0．05）；復合法組2個探針藥cmax均顯著性下降（P＜0．05），C l／F顯著升高（P＜0．05）；免疫組2個探針藥的藥代參數(shù)均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。與正常對照組相比，4個探針藥的半衰期t1／2變化均不明顯。

Tab．2 Accuracy，precision and recovery of amfebutamone and midazolam in rat plasma by LC-MS

Fig．3 Concentration-time curves of amfebutamone（A）and midazolam（B）in rats with liver cirrhosis．All rats of the five groups were ig administered with amfebutamone 15 mg·kg－1and midazolam 10 mg·kg－1．Then the blood samples（0．3 m L）were collected from the tail vein into heparinized 1．5 m L polythene tubes at0．083，0．25，0．5，1，1．5，2，2．5，3，4，6，8，12 and 24 h after administration．，n＝6－10．

Tab．3 Pharmacokinetic parameters of amfebutamone and midazolam in rat plasm

3 討論

肝硬化是嚴重威脅人類健康的常見疾病，以肝纖維化和肝細胞結節(jié)性增生為基本病變特征［7］。肝損傷時產(chǎn)生的炎癥因子能通過各種促纖維化因子促進HSC的活化，分泌多種細胞因子并產(chǎn)生活性氧，使HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谀z原能力更強的肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），致使ECM大量沉積，形成肝纖維化。肝纖維化和肝硬化時，肝臟藥物代謝和抗氧化功能降低。作為參與內(nèi)、外源性化合物Ⅰ相代謝反應的重要超家族酶系，肝硬化大鼠體內(nèi)CYP的研究對于肝損傷患者的臨床用藥具有一定的參考價值。

CYP超家族包括14個家族，26個亞家族，50多種具有催化功能的亞型。CYP1，CYP2和CYP3是參與藥物代謝的主要家族，其中CYP3A代謝約50%的臨床藥物和內(nèi)源性物質(zhì)，CYP3A與CYP2B共同參與了約75%的經(jīng)CYP代謝的臨床藥物的代謝。胡小玲等［8］采用小腸黏膜上皮細胞微粒體體外實驗，結果表明肝硬化時大鼠的小腸CYP3A活性明顯升高，達到正常對照組的3．4倍。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化大鼠的肝微粒體蛋白含量明顯降低，表明大鼠肝CYP酶活性很可能降低。這可能與機體對肝硬化時口服藥物經(jīng)肝代謝能力降低的代償作用有關。

CCl4組2個探針藥的AUC與cmax均顯著升高，說明探針藥在體內(nèi)血藥濃度升高。腸道吸收增加與體內(nèi)消除變慢均能引起血藥濃度升高。由于藥物的消除半衰期主要與代謝藥物的肝藥酶活性有關，而半衰期無顯著性差異，因此Cl／F的下降可能與CCl4反復作用于肝臟引起急、慢性肝臟損害，使肝代謝下降相關。表明CCl4組大鼠肝CYP3A與CYP2B活性降低，CCl4引起肝損害與CCl4被肝微粒體內(nèi)依賴于CYP的混合功能酶的激活，產(chǎn)生自由基CCl3及Cl－1有關。

TAA組2個探針藥的AUC，cmax，tmax與MRT均顯著升高，而清除率C l／F均顯著性下降，這表明TAA組肝硬化大鼠體內(nèi)CYP3A與CYP2B酶活性也降低。TAA能延長肝細胞有絲分裂過程，并阻礙RNA從胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，進而影響依賴酶CYP的代謝過程，最終形成肝細胞壞死。

復合法組cmax均顯著降低，Cl／F均升高，這可能與復合法組大鼠在給予CCl4的同時飲酒高脂喂飼有關。乙醇可使小鼠肝組織NF-κB表達升高，激活炎癥反應，使HSC活化并伴有NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活及c-myb基因表達的增強，而c-MYB蛋白可結合α-SMA基因調(diào)控區(qū)表達α-SMA［9］。

與正常對照組相比，免疫組大鼠探針藥的藥代參數(shù)均無統(tǒng)計學意義。這可能是由于BSA引發(fā)機體免疫應答反應，在肝門脈匯管區(qū)形成免疫復合物沉積，從而引起局部炎癥反應，并刺激膠原增生而造成肝組織纖維化，以致于不影響CYP酶活性。

模型組探針藥的半衰期t1／2變化均無顯著性差異，這可能與肝硬化大鼠的小腸黏膜上皮細胞抗氧化功能和膜流動性明顯降低有關。由于小腸CYP活性升高，使氧化代謝過程中產(chǎn)生過多的氧自由基，引起膜結構與功能的改變，并進一步影響膜通透性、酶蛋白活性，降低機體抗氧化功能［10］。

實驗過程中，大鼠死亡的主要原因可能為對藥物的耐受性比較差和急性肝壞死，而復合法組大鼠死亡率偏高，可能與大鼠厭酒以及高脂喂飼有關。

總之，CCl4和TAA誘導的肝硬化模型大鼠體內(nèi)CYP2B6和CYP3A酶活性降低，易造成某些主要經(jīng)肝代謝的藥物蓄積。以肝硬化動物模型進行藥物代謝方面研究時，應當注意到CYP的變化情況。

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（本文編輯：付良青）

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Changes in enzyme activity of CYP2B6 and CYP3A in rats with liver cirrhosis

ZHU Jia-yin1，WANG Xian-qin2，ZHU Zi-hua2，HU Lu-feng3，CHEN Xi-wen1
（1．Laboratory Animal Center，2．School of Pharmacy，3．the First Affiliated Hospital，Wenzhou Medica l University，Wenzhou 325035，China）

OBJECTlVETo study the changes of enzyme activity of CYP2B6 and CYP3A in rats with liver cirrhosis．METHODSFifty male SD rats were random ly divided into five groups（n＝10）：normal control（NC）group，carbon tetrachloride（CCl4）group（the rats were ip given 30%CCl42 m L·kg－1twice weekly for 7 weeks），thioacetamide（TAA）group（the rats were given 0．03%TAA in drinking water for 5 weeks and then 0．04%TAA for another5 weeks），composite method（CM）group（the rats were sc given 40%CCl4once every 3 d and high-fat with 15% alcoholdiet）and immune method（IM）group（the rats were sc given bovine serum album in 20－40 mg·kg－1for11 weeks）．All these rats were ig administered with amfebutamone 15 mg·kg－1and midazolam 10 mg·kg－1．Then，the blood samples（0．3 m L）were collected from the tail vein into heparinized 1．5 m L polythene tubes at 0．083，0．25，0．5，1，1．5，2，2．5，3，4，6，8，12 and 24 h after administration．The plasma concentrations of amfebutamone and midazolam were measured by LC-MS．RESULTSThere was obvious difference in plasma concentrations and corresponding pharmacokinetic parameters of amfebutamone and midazolam in rats after administration．Com pared with the NC group，the AUC of two probe d rugs increased significantly（P＜0．05），so did the cmax（P＜0．01），while the Cl／F decreased significantly（P＜0．05）in CCl4and TAA groups．In CM group，the cmaxof two probe drugs decreased significantly（P＜0．05）．However，pharmacokinetic parameters of two probe drugs in IM group hardly changed compared with the control group．CONCLUSlONIn CCl4and TAA groups，the enzyme activity of CYP2B6 and CYP3A decreases in rats with liver cirrhosis．

probe；liver cirrhosis；pharmacokinetic；CYP2B6；CYP3A

CHEN Xi-wen，E-mail：chenxiwen7115＠163．com，Tel：（0577）86689908

R969．1

A

1000-3002（2014）01-0081-07

Foundation item：The project supported by Laboratory Animal Science and Technology Prog ram of Zhejiang Province（2012C37101）；Fund of Zhejiang Education Burean（Y201119284）；Technological Research Program of Wenzhou City（Y20110160）；and Technological Research Program of Wenzhou City（Y20110134）

2013-02-01 接受日期：2013-08-25）

浙江省科技廳實驗動物科技計劃項目（2012C37101）；浙江省教育廳科研基金（Y201119284）；溫州市科技局科研基金（Y20110160）；溫州市科技局科研基金（Y20110134）

朱加銀（1983－），男，實驗師，碩士，主要從事醫(yī)學實驗動物學研究，E-mail：zjiayin＠163．com。

陳錫文，E-mail：chenxiwen7115＠163．com，Tel：（0577）86689908