鄭桃林 王 哲 劉 超 何 偉

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是老年癡呆的一種最常見(jiàn)類(lèi)型，是一種多因素引起的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，β－樣淀粉樣多肽（β－amyloid，Aβ）沉積以及tau蛋白磷酸化、老年斑形成（senile plaques，SP）、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NETS）是其病理學(xué)特征。Aβ具有神經(jīng)毒性，當(dāng)前應(yīng)用Aβ25－35片段誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立AD細(xì)胞模型已被廣泛用于體外研究實(shí)驗(yàn)。cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白（cAMP responsive element binding protein CREB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中具有環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元（CRE）的基因轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)元再生、突觸形成及學(xué)習(xí)記憶等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。臨床資料顯示，在AD患者海馬組織cAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB（phosphorylated CREB，p－CREB）水平相應(yīng)下降，證實(shí)CREB、P－CREB與AD的形成有密切的關(guān)系。

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是一種從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮類(lèi)化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究ICA具有多方面的藥理作用，近年來(lái)淫羊藿苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及其機(jī)制研究日益增多，具有抗癡呆、抗衰老、抗抑郁、改善缺血性腦損傷等作用［1，2］。本課題組前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以淫羊藿為君藥的中藥小復(fù)方（腦靈湯）具有一定的抗癡呆作用［3，4］，并發(fā)現(xiàn)其能上調(diào)模型鼠海馬P－CREB的表達(dá)水平，從而改善模型鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力［5］，但其具體機(jī)制仍不十分清楚。根據(jù)以上前期研究，并參考現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，本實(shí)驗(yàn)選用中藥單體淫羊藿提取物ICA作為實(shí)驗(yàn)材料，以采用Aβ25－35孵育的PC12細(xì)胞構(gòu)建AD細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，探討ICA抗癡呆的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。淫羊藿苷由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供。Aβ25－35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胰蛋白酶購(gòu)自江蘇碧云天生物科技研究所，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbio公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏化學(xué)放光顯色試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞的培養(yǎng)液成分為90%高糖DMEM培養(yǎng)基（含青霉素及鏈霉素濃度均為100 U／ml）和10%胎牛血清；二氧化碳培養(yǎng)箱中條件設(shè)置為37℃、5%CO2、飽和濕度；更換細(xì)胞培養(yǎng)液頻率約為2～3次／d，待細(xì)胞達(dá)70%～80%豐度時(shí)進(jìn)行傳代；藥物干預(yù)及各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 Aβ25－35孵育PC12細(xì)胞制備AD細(xì)胞模型

將1 mg純度為97%的Aβ25－35溶于雙蒸水中使其終濃度為1μmol／mL，放置于－20℃冰箱備用；臨用前置于37℃孵育1周，使其凝聚；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞調(diào)節(jié)其細(xì)胞濃度1×105／ml；取調(diào)節(jié)好濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液約2 ml接種于6孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后加入Aβ繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Aβ組、ICA組、LY組、LY＋I(xiàn)CA組；除Control組外，余下4組Aβ的濃度均為20μmol／L；ICA組：先加ICA孵育1 h后再加Aβ，ICA濃度為20μmol／L；LY組的LY294002濃度為50μmol／L；LY＋I(xiàn)CA組為先加LY294002濃度為50μmol／L孵育1 h，再加ICA和Aβ使其濃度為20μmol／L。LY294002為PI3K／Akt信號(hào)通路經(jīng)典抑制劑。

1.2.4 Western－Blot檢測(cè)CREB、p－CREB、Akt、p－Akt蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞收集于干凈Ep管中，取蛋白裂解液按每1×106個(gè)細(xì)胞加200 ul蛋白裂解液；RIPA裂解液處理細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；Bradford法測(cè)定各組樣品蛋白質(zhì)含量；SDS－PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用抗體孵育和顯色，將膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。電泳：濃縮膠50 V，分離膠100 V，電泳時(shí)間3 h左右；轉(zhuǎn)膜：CREB1，p－CREB1，AKT，p－AKT，380 mA1.5 h。封閉：5%脫脂牛奶（TBST稀釋?zhuān)?7℃2 h；一抗孵育：4℃孵育過(guò)夜（TBST稀釋?zhuān)幌茨ぃ篢BST，每次5 min，共6次；二抗孵育：室溫1 h（TBST稀釋?zhuān)蚨?∶5000，兔 二 抗1∶4000、鼠 二 抗1∶2000）；洗 膜：TBST，每次5 min，共6次；顯影：曝光時(shí)間2～10 min。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，多組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則進(jìn)行單因素方差分析的單向分類(lèi)方差分析。進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較則采用LSD－t檢驗(yàn)。若方差不齊則進(jìn)行變量轉(zhuǎn)化后采用單向類(lèi)方差分析或采用Kruskal－Wills H檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞CREB、P－CREB表達(dá)水平的比較

各組培養(yǎng)結(jié)束后Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞P－CREB（Ser－133）、CREB蛋白表達(dá)水平，利用IPP測(cè)量平均灰度值。在相對(duì)分子量為43 kD處，可見(jiàn)清晰的P－CREB、CREB條帶，以GAPDH為內(nèi)參。與對(duì)照組比較，Aβ處理PC12細(xì)胞使P－CREB／CREB表達(dá)下調(diào)，差異有顯著性（P＜0.01）；與Aβ組比較，ICA能夠明顯增加P－CREB／CREB比值，差異有顯著性（P＜0.01）；與ICA組相比較，ICA＋LY組加入LY預(yù)處理后下調(diào)P－CREB／CREB表達(dá)水平，差異有顯著性（P＜0.05）（表1、圖1）。

圖1 Western－blot檢測(cè)各組CREB、P－CREB蛋白表達(dá)水平

表1 各組PC12細(xì)胞P－CREB／CREB表達(dá)水平比較（ˉx±s）

2.2 各組Akt與p－Akt蛋白表達(dá)水平的比較

各組培養(yǎng)結(jié)束后Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Akt及P－AktSer－473的蛋白表達(dá)水平，利用IPP測(cè)量平均灰度值。在相對(duì)分子量為60 kD處，可見(jiàn)清晰的P－Akt、T－Akt條帶，以β－actin為內(nèi)參。與對(duì)照組比較，Aβ組p－Akt水平明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01）；與Aβ組比較，ICA組p－Akt水平明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；與ICA組比較，ICA＋LY組p－Akt水平明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01）（表2、圖2）。

圖2 Western－blot檢測(cè)的各組Akt、p－Akt蛋白表達(dá)水平

表2 Western blot法檢測(cè)的各組Akt磷酸化水平（ˉx±s）

3 討 論

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種多因素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD以獲得性持續(xù)進(jìn)行性記憶減退、認(rèn)知功能障礙、言語(yǔ)障礙、時(shí)間與空間定向能力障礙、行為異常以及性格改變?yōu)樘卣鳌D發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，在眾多關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)中目前被普遍接受的是Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)［6］。Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)核心理論：在遺傳或環(huán)境因素改變的情況下腦內(nèi)生成具有神經(jīng)毒性作用的β淀粉樣蛋白，Aβ通過(guò)一系列復(fù)雜的病理機(jī)制導(dǎo)致大腦神經(jīng)元變性、缺失，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能損害，即腦內(nèi)異常沉積的Aβ是造成AD記憶認(rèn)知損傷的始動(dòng)因素，是誘發(fā)該病的中心環(huán)節(jié)。

CREB是細(xì)胞存活所必備的蛋白分子之一［7］。臨床資料顯示，AD患者海馬組織CAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB水平相應(yīng)下降，證實(shí)CREB、P－CREB與AD的形成有密切的關(guān)系。有研究顯示過(guò)量Aβ可抑制海馬cAMP／PKA／cREB信號(hào)通路，致海馬CAI LTM功能的損害，進(jìn)而影響突觸可塑性，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究也發(fā)現(xiàn)Aβ組與對(duì)照組比較，P－CREB／CREB表達(dá)水平下降。研究報(bào)道淫羊藿苷（ICA）可以改善腦卒中后癡呆動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力，并能夠增加CREB的磷酸化水平［8］。本研究發(fā)現(xiàn)與Aβ組比較，ICA使PCREB表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步證明ICA可以促進(jìn)CREB磷酸化，上調(diào)P－CREB的表達(dá)水平而發(fā)揮保護(hù)作用。近年來(lái)關(guān)于淫羊藿苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及其機(jī)制研究日益增多，且表明其具有抗抑郁、改善缺血性腦損傷、抗癡呆、抗衰老作用［1，2］。淫羊藿苷可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷、平衡細(xì)胞內(nèi)鈣離子流穩(wěn)態(tài)、抑制β分泌酶表達(dá)、糾正能量代謝失衡等方式抗Aβ毒性［9，10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與Aβ組比較，ICA組P－CREB表達(dá)水平明顯上調(diào)，這進(jìn)一步證明ICA可以促進(jìn)CREBser－133磷酸化，上調(diào)P－CREB的表達(dá)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

Akt是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，一般在Ser－473和Thr－308位點(diǎn)磷酸化而激活，能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，與多樣化角色相關(guān)如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、糖代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、血管生成和細(xì)胞存活［11］。PI3K／Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促細(xì)胞存活轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Akt可正性調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）轉(zhuǎn)錄因子，直接磷酸化CREB，Akt磷酸化CREB后使CREB連接到相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)，誘導(dǎo)cAMP反應(yīng)元件基因表達(dá)。PI3K／Akt信號(hào)通路激活后引起CREBSer－133磷酸化，促進(jìn)一些蛋白的轉(zhuǎn)錄而維持細(xì)胞存活［12］。JosephPeltier等在對(duì)PI3K／Akt／CREB調(diào)控成人海馬祖細(xì)胞增殖研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白的激活發(fā)生在被堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF－2）刺激的細(xì)胞中，當(dāng)Akt信號(hào)被抑制時(shí)CREB的活化受限［13］，表明Akt信號(hào)部分通過(guò)CREB介導(dǎo)，Akt和CREB之間存在鏈接。磷酸化的CREB直接或間接激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表達(dá)某些蛋白分子如c－fos、bcl－2以及某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Brain－Derived Neurotrophic Factor，BDNF）等，這些基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)著神經(jīng)元在應(yīng)激性損傷后的再生、存活和修復(fù)。CREB可以增加BDNF等可以激活PI3K／Akt信號(hào)通路的蛋白分子表達(dá)而形成正反饋促進(jìn)細(xì)胞存活［14］。激活PI3K／Akt通路可以引起CREB的磷酸化，而CREB磷酸化可以增加BDNF的表達(dá)，反過(guò)來(lái)BDNF可以通過(guò)激活PI3K／Akt信號(hào)通路拮抗Aβ神經(jīng)毒作用，減少Aβ引起的神經(jīng)元凋亡，促神經(jīng)元存活，改善突觸可塑性，改善認(rèn)知功能障礙［15］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到與ICA組比較，ICA＋LY組PCREB／CREB表達(dá)水平下調(diào)，提示ICA預(yù)處理能夠促進(jìn)CREB磷酸化，上調(diào)P－CREB表達(dá)，PI3K／Akt抑制劑LY294002能夠抑制ICA誘導(dǎo)的CREB磷酸化。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)LY阻斷PI3K／Akt信號(hào)通路后，ICA處理不僅仍可以上調(diào)P－CREB的表達(dá)水平，而且P－Akt／Akt的表達(dá)水平也上調(diào)?？紤]ICA有可能通過(guò)別的通路發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)多層次、多途徑、多靶點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ICA可增加Aβ25－35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中p－CREB表達(dá)水平，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K／Akt通路有關(guān)，這為今后治療AD提供了新的靶點(diǎn)，但仍然有許多問(wèn)題需進(jìn)一步研究，如ICA通過(guò)活化Akt還對(duì)下游哪些蛋白發(fā)揮作用、除了該通路是否其保護(hù)作用還與別的通路有關(guān)等。另外，AD發(fā)病生理病理機(jī)制都十分復(fù)雜，在治療該疾病時(shí)要想有效控制該病臨床癥狀及病程發(fā)展，不能只局限在某一種或某一類(lèi)藥物，必須采取多途徑、多靶點(diǎn)、多方位綜合治療，這可能會(huì)成為未來(lái)治療AD的一種新趨勢(shì)。

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