陳高峰 周振華 李 曼 孫學華 高月求，4 金樹根△

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病研究所(上海，201203) 2.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室 3.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院細胞免疫室 4.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病科

在進行中藥抗肝損傷的防治研究中，不可避免要用到異硫氰酸萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)染毒造模制作的肝內(nèi)膽汁淤積這一動物模型。我們在采用ANIT 制作小鼠肝內(nèi)膽汁淤積這一動物模型時發(fā)現(xiàn)，不同年齡的動物染毒后其血清膽紅素上升情況不一，同時同一年齡不同性別的動物染毒后其血清膽紅素上升情況也不一致。鑒此我們擬研究年齡與性別對ANIT 中毒所致小鼠急性肝損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康昆明小鼠64 只(雌34 只，雄30 只)，其中5 周齡20 只(雌雄各10 只)，10 周齡24 只(雌14 只，雄10只，其中懷孕2 周母鼠4 只)，20 周齡20 只(雌雄各10 只)。試驗動物飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫18℃～24℃，光照12h，自由攝食與水，于試驗收集血和肝組織樣本前12h 禁食而不禁水。

1.2 試劑儀器設(shè)備 ANIT，化學純，北京通縣育才精細化工廠提供。血清ALT、AST、DBil 檢測試劑盒，由上海華東菱產(chǎn)品提供。主要設(shè)備:全自動生化分析儀(卓越330 型，上?？迫A)，萊卡脫水機(ASP 300S)、萊卡包埋機(EG1150H)，萊卡切片機(RM2235)及奧林巴斯顯微鏡(DP71)。

1.3 造模 除各年齡雌雄小鼠各5 只作為正常對照組外，各年齡雌雄小鼠其他小鼠采用溶于適量植物油中配制成14 mg/ml 濃度的ANIT 按70mg/Kg (0.1ml/20g)劑量經(jīng)口灌胃造模，染毒48h 后收集血清并切取肝組織樣本供檢查用。

1.4 觀測指標 ①小鼠一般情況 包括小鼠的活動、毛色、飲水、攝食及死亡率。②血清生化ALT、AST、DBil 檢測。③肝組織病理學檢測，采用常規(guī)固定脫水包理切片和HE 染色。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 軟件，ANOVA 處理組間差別，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況變化 油劑(正常與ANIT 造模)經(jīng)口灌胃1、2h 后致小鼠毛皺，ANIT 造模組小鼠活動、攝水與食均有所減少，在預實驗中ANIT 100mg/Kg 造模致部分雄性大鼠死亡。

2.2 肝組織病理學改變 正常雄性與雌性小鼠肝組織切面圖見插頁圖1 與圖2 所示。ANIT 中毒48h 后可見膽管上皮細胞腫脹變性壞死與增生，膽管周邊肝細胞點狀、灶狀壞死，炎性細胞浸潤。ANIT 中毒后，與5 周齡雌性小鼠相比，5 周齡雄性小鼠肝組織變性壞死明顯加重，參見插頁圖3、圖4。ANIT 中毒10 周齡雄性小鼠比雌性小鼠肝組織病變更加明顯，而10 周齡懷孕雌性小鼠較同齡ANIT 中毒的雄性小鼠相比，其肝組織病變稍輕，但較非孕雌性小鼠相比似顯加重，參見插頁圖5～圖7。隨著年齡增加，ANIT 中毒20 周齡小鼠肝組織病變加重，仍以雄性小鼠肝組織病變最為明顯，參見插頁圖8、圖9。

2.3 不同年齡及不同性別小鼠血清生化指標檢測情況見表1。

表1 不同年齡及不同性別小鼠血清生化指標檢測比較(±s)

表1 不同年齡及不同性別小鼠血清生化指標檢測比較(±s)

與ANIT 中毒同齡雌性小鼠相比，* P ＜0.05;與5 周齡同性別ANIT中毒小鼠相比，#P ＜0.05;與10 周齡同性別ANIT 中毒小鼠相比，@P ＜0.05

3 討論

一直以來，作為膽管上皮細胞毒的ANIT 被廣泛用于制作以肝內(nèi)膽汁淤積為特征的急性肝損傷的動物造模。因ANIT 中毒致肝內(nèi)膽管炎甚至膽管消失，有研究采用ANIT 慢性飼食染毒造模，用于制作肝內(nèi)膽汁淤積為特征的慢性肝病動物模型，該動物模型采用的ANIT 無致癌原性，而且因其含有抗癌藥效團——異硫氰酸而通過影響P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug resistance-associated protein MRP)1 的藥物外排而介導其抗癌活性，免疫學上表現(xiàn)為肝內(nèi)Th1 細胞因子譜改變［1～6］。

作為膽管上皮細胞毒，ANIT 進入體內(nèi)后，先在肝細胞內(nèi)與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合形成ANIT-GSH 復合物 (結(jié)合型ANIT)并分泌到膽汁中，結(jié)合型ANIT 不穩(wěn)定，在膽汁中很快發(fā)生分離而直接損傷膽管上皮細胞，引起膽管上皮細胞明顯增生，膽管周圍發(fā)生肝細胞點狀、灶狀壞死并有大量的中性粒細胞浸潤，血清生化以高膽紅素血癥為特征。因此研究ANIT 中毒防治方法，首先需要了解ANIT 在體內(nèi)特別是肝內(nèi)代謝及致病機制。ANIT 與膽紅素等大多數(shù)有機陰離子一樣，首先由肝細胞的肝竇面細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白如有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(Organic anion transporting polypeptides，OATPs，如人OATP;大鼠oatp1、oatp2、oatp3)，肝特異性轉(zhuǎn)運蛋白(Liverspecific transporter，Rlst/HLST)和/或有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白(Organic anion transporters，OATs，如OAT2、OAT3)帶入肝細胞內(nèi)，之后在肝細胞內(nèi)與GSH 結(jié)合，形成結(jié)合型ANIT，并為肝細胞的毛細膽管面細胞膜上的MRP2 介導分泌入膽汁，另外已知在膽汁分泌不暢時由位于肝細胞橫向的細胞膜上的MRP3 介導結(jié)合型膽紅素返流入血，經(jīng)腎臟排泄。結(jié)合型ANIT 也可能通過MRP3 返流入血，經(jīng)腎臟排泄?？紤]ANIT毒性與膽汁內(nèi)ANIT 濃度密切相關(guān)，因此抗ANIT 中毒最佳治療應是降低膽汁中的ANIT 濃度，而降低膽汁中的ANIT 濃度的方法有下調(diào)肝竇面細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白以減少肝細胞的ANIT 攝取、減少ANIT 代謝和通過下調(diào)MRP2 而減少ANIT 膽汁排泄或通過上調(diào)MRP3 而促進ANIT 返流入血經(jīng)腎臟排泄。當然，增加膽汁水分分泌以降低膽汁中ANIT 濃度亦可減少ANIT 的毒性，另外膽汁水分分泌的促進與肝細胞ANIT 攝取、代謝和結(jié)合型ANIT 分泌入膽汁的促進同時聯(lián)用，在降低膽汁中ANIT 濃度同時，通過快速體內(nèi)(特別是肝內(nèi)ANIT 從膽汁中)排泄也可減少ANIT 的毒性。事實上，ANIT 中毒致有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白Oat1 和Oat3 表達下調(diào)而MRP2 表達上調(diào)，有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白Oat1 和Oat3 底物JBP485 處理后被ANIT 中毒下調(diào)了的Oat1 得以上調(diào)和上調(diào)了的MRP2 進一步上調(diào)，通過增加膽汁流而減輕ANIT 肝損傷［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，ANIT 75mg/Kg 經(jīng)口灌胃染毒可致5 周齡小鼠血清ALT、AST 和DBil 明顯上升，肝組織學呈明顯淤膽改變。隨著年齡增加，ANIT 中毒所致小鼠上述改變更加明顯。雄性小鼠明顯重于雌性小鼠，雄性老年小鼠出現(xiàn)大量死亡，雌性小鼠懷孕后肝損傷不顯明顯變化(轉(zhuǎn)氨酶下調(diào)而膽紅素上調(diào))。ANIT 造模中關(guān)于年齡與性別因素的影響，目前研究較少，有研究認為雌性小鼠肝內(nèi)Oatpla1 表達明顯低下(雄性小鼠的0.1 倍)、MRP2 表達稍低(0.9 倍)、MRP3 表達上調(diào)(2.1 倍)，高脂飲食通過減少雌性小鼠肝內(nèi)MRP2 表達而致肝內(nèi)ANIT 蓄積，膽汁中ANIT 減少而減輕ANIT 肝損傷［8］，說明雌激素抑制肝細胞攝取不明顯、明顯抑制ANIT 的膽汁分泌和促進ANIT 返流入血從腎排泄，這也解釋了我們實驗結(jié)果雌性小鼠肝損傷相對為輕。

本研究發(fā)現(xiàn)，ANIT 所致的以肝內(nèi)膽汁淤積為特征的肝損傷自成年后開始呈增齡性改變，同一年齡雄性鼠肝損傷重于雌性鼠，類似于人類PSC 改變，因此我們認為不失為一PSC的動物模型。事實上，具有雄性激素作用的中藥淫羊藿水煎液及其有效成分淫羊藿苷雖然有效拮抗四氯化碳中毒性肝損傷，但其治療性給藥卻加重ANIT 中毒小鼠肝損傷［9］，進一步表明小鼠ANIT 中毒所致肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷更類似于人類PSC，適于PSC 防治藥物的實驗研究。

ANIT 染毒導致體內(nèi)淋巴細胞糖皮質(zhì)激素受體下調(diào)而體內(nèi)糖皮質(zhì)激素上調(diào)［10］，國內(nèi)多采用這類動物模型預防性給藥進行研究，有研究發(fā)現(xiàn)外源性糖皮質(zhì)激素雖預防性給藥有減輕ANIT 中毒所致肝損傷作用，而治療性給藥則加重ANIT 中毒所致肝損傷［11］。但考慮臨床用藥多為治療性用藥，因此藥物干預的實驗方案設(shè)計上，應多采用或結(jié)合防治性或治療性給藥較為合適。

采用熊去氧膽酸(UDCA)干預ANIT 染毒所致的肝內(nèi)膽汁淤積的實驗研究報導結(jié)果不一［12，13］，臨床上UDCA 治療PSC 雖然能改善肝功能，但對死亡率和肝組織學的影響不明顯［14］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)對于早期PSC，UDCA 高劑量治療反而促進病情進展［15］，也有研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)和高劑量UDCA 對PSC 進展沒有作用［16］，還發(fā)現(xiàn)伴有結(jié)腸炎的患者采用UDCA治療絕大多數(shù)在治療第一年內(nèi)出現(xiàn)腸癌［17］，另一研究也發(fā)現(xiàn)伴有潰瘍性結(jié)腸炎的PSC 患者采用高劑量UDCA 治療與結(jié)直腸腫瘤發(fā)展有關(guān)［18］。因此有必要采用此一模型尋找新的抗肝內(nèi)膽管病變、肝內(nèi)膽汁淤積的藥物，以便更好地治療PSC 等自身免疫性肝臟疾病。

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