劉肄輝 張永華 劉 莉 周紅娟 馮 慧

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝病科(浙江 杭州，310003)

Th9 (輔助性T 淋巴細(xì)胞9)是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，在一些疾病中被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用，有促炎效應(yīng)［1，2］，其在分化與功能上與Treg (調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞)具有一定的相關(guān)性，而Treg 在慢性乙型肝炎(CHB)中主要起免疫抑制作用，有抗炎效應(yīng)。CHB 患者中是否存在Th9/Treg 失衡尚未見報(bào)道。我們應(yīng)用健脾補(bǔ)腎中藥聯(lián)合核苷 (酸)類似物治療CHB 患者，發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)調(diào)節(jié)Th9/Treg 提高CHB 的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 選擇浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝病科符合抗病毒治療的CHB 患者100 例，分為觀察組與對(duì)照組，每組各50 例;同時(shí)選擇健康志愿者50 例，由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)并簽署知情同意書。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》［3］，年齡、性別、病程等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。所有患者6 個(gè)月內(nèi)未接受抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療。排除合并HAV、HCV、HEV 等病毒感染、排除合并脂肪性、酒精性和遺傳代謝性肝病、失代償性慢性肝病以及自身免疫相關(guān)的其他疾病、無(wú)心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)重大疾病及精神病患者;排除妊娠或哺乳期婦女。

1.2 治療方法 觀察組:服用核苷(酸)類似物，其中拉米夫定16 例(賀普丁，葛蘭素史克公司生產(chǎn))，100mg/次，1 次/d;阿德福韋酯25 例(賀維力，葛蘭素史克公司生產(chǎn))，10mg/次，1 次/d;恩替卡韋9 例(博路定，上海施貴寶公司生產(chǎn))，0.5mg/次，1 次/d。同時(shí)加用健脾補(bǔ)腎中藥治療，組方為黃芪、紫河車、至靈菌絲、女貞子、三七，由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室加工成水煎劑200ml，每天分二次口服。對(duì)照組僅服核苷(酸)類似物，其中拉米夫定19 例;阿德福韋酯27 例;恩替卡韋4 例;產(chǎn)地、用法用量同觀察組。療程24 周。兩組觀察期間停用一切保肝降酶等藥物。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 乙肝病毒血清標(biāo)志物、ALT、HBV DNA 等指標(biāo)檢測(cè) 每4 周測(cè)定1 次。

1.3.2 外周血Th9 細(xì)胞檢測(cè) 全血標(biāo)本:100μl 不含血清的RPMI 1640，1∶1 等體積稀釋PBMC:200μl(2 ×106/ml)=4 ×105個(gè)細(xì)胞，加1μg/ml PMA 工作液5μl，50μg/ml Iomomycin 工作液4μl，0.1mg/ml Momensin 工作液3.4μl，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6h?；靹颍尤?μl CD3 -FITC 和5μl CD8 -PE-Cy5，室溫，避光孵育15 min;分成2 管，每管加入100μl 已染色的全血;每管中加入100μl Fix＆Perm中的Reagent A (即固定液)，室溫，避光孵育15min;每管中加入3ml PBS，1200 rpm 離心5min，棄除上清。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent B (即破膜和溶血)，同時(shí)各管中按下表加入相應(yīng)的抗體各10μl:Mouse IgG1 -PE，IL -9 -PE;室溫，避光孵育15min。每管中加入3ml PBS，1200 rpm 離心5min，棄除上清;0.5ml PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。治療前后各檢測(cè)1 次。

1.3.3 Treg 細(xì)胞檢測(cè) 在每個(gè)流式上樣管中加入100μl 準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1 ×106個(gè)。按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原CD4、CD25。用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer 或預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋渦混勻。避光4℃孵育30～60min。加入2ml Permeabilization Buffer (ebioscience，目錄號(hào)00 -8333)工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。

重復(fù)第6 步操作洗滌細(xì)胞。加入稀釋好的2%(2μl)的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer 工作液進(jìn)行稀釋)100μl，避光4℃孵育15min。封閉液無(wú)需洗去，直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3 抗體20μl，避光4℃孵育至少30min。加入2ml Permeabilization Buffer 工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。重復(fù)上一步洗滌細(xì)胞。用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)分析。治療前后各檢測(cè)1 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0 版本。計(jì)量資料以(± s)表示，兩組均值比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB 組與健康對(duì)照組Th9、Treg、Th9/Treg 的比較 見表1。

表1 乙肝病毒感染者與健康對(duì)照組Th9、Treg 的比較(±s)

表1 乙肝病毒感染者與健康對(duì)照組Th9、Treg 的比較(±s)

與對(duì)照組比較* P ＜0.05

2.2 健脾補(bǔ)腎法對(duì)CHB 患者Th9/Treg 平衡的影響觀察組Th9、Treg、Th9/Treg 治療前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，對(duì)照組Th9、Treg、Th9/Treg 治療前后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);觀察組與對(duì)照組Th9、Treg、Th9/Treg 治療后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 健脾補(bǔ)腎法對(duì)CHB 患者Th9/Treg 平衡的影響［n (%)］

2.3 健脾補(bǔ)腎法對(duì)CHB 患者療效的影響 觀察組ALT 復(fù)常率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，觀察組HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，觀察組HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表3。

表3 兩組患者療效比較［n (%)］

3 討論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)CD4+Th 細(xì)胞除Thl 細(xì)胞和Th2 細(xì) 胞、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Th17 外，可能還存在一個(gè)新的Th 細(xì)胞亞群-Th9［4，5］。目前研究表明，Th9 細(xì)胞在哮喘和結(jié)核病的病理過(guò)程中起著重要作用［1，2］。作為新發(fā)現(xiàn)的T 細(xì)胞亞群，IL-9 是其主要的效應(yīng)因子，是促進(jìn)炎癥發(fā)生的關(guān)鍵因素［5］，但在CHB 中Th9 的具體表達(dá)狀況尚未見報(bào)道。另一類CD4+T 細(xì)胞亞群-CD4+CD25+Foxp3+Treg 被認(rèn)為具有免疫抑制和抗炎作用［6］。在缺乏IL-4 的情況下，TGF-β 可誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞向Treg 轉(zhuǎn)化，起到抑制炎癥的作用，當(dāng)加入IL-4 后初始T 細(xì)胞明顯向Th9 轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生致炎效應(yīng)，推測(cè)其在分化上具有相關(guān)性;從Th9 具有致炎作用，Treg 具有抗炎作用，推測(cè)其在功能上具有拮抗性。本研究結(jié)果顯示CHB 患者Th9、Treg 頻率均比健康對(duì)照高，Th9、Treg、Th9/Treg 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明CHB 患者Th9/Treg 存在免疫失衡，為影響CHB 的重要因素。

CHB 的發(fā)病機(jī)理中至少包括宿主免疫、病毒兩大因素，中醫(yī)認(rèn)為CHB 病因病機(jī)為“邪毒為標(biāo)，正虛為本”。治療上應(yīng)牢牢把握正虛邪實(shí)這一主線，采用扶正祛邪之法。但目前CHB 的治療西醫(yī)主要以核苷(酸)類似物為主，側(cè)重于抗病毒，作用單一，我們認(rèn)為核苷(酸)類似物的抗病毒作用類似于中藥的清熱解毒，兩者聯(lián)用時(shí)，中藥處方應(yīng)有所改變，此時(shí)應(yīng)以扶正中藥為主，達(dá)到扶正固本的目的。健脾補(bǔ)腎方以黃芪、紫河車、至靈菌絲等為主藥，功擅扶正托毒，現(xiàn)代研究證實(shí)上述藥物具有良好的免疫調(diào)節(jié)等功效［7，8］。我們?cè)谇捌谙嚓P(guān)研究中發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎法聯(lián)合拉米夫定治療CHB 具有增效減毒的作用，其機(jī)理與中醫(yī)健脾補(bǔ)腎中藥能夠調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞功能、CD4+T/CD8+T 細(xì)胞，Th1/Th2 等機(jī)體細(xì)胞免疫因素有關(guān)［9～11］。

本研究結(jié)果顯示:觀察組Th9、Treg、Th9/Treg治療前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，對(duì)照組Th9、Treg、Th9/Treg 治療前后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，觀察組與對(duì)照組Th9、Treg、Th9/Treg 治療后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。結(jié)果表明單一核苷(酸)類似物抗病毒治療對(duì)Th9/Treg 失衡影響有限，而健脾補(bǔ)腎中藥可以促進(jìn)Th9/Treg 失衡的恢復(fù)，與核苷(酸)類似物有協(xié)同增效的作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)觀察組ALT 復(fù)常率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，觀察組HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，說(shuō)明健脾補(bǔ)腎中藥可以提高核苷(酸)類似物治療CHB 的早期應(yīng)答療效，早期應(yīng)答與遠(yuǎn)期療效密切相關(guān)，早期應(yīng)答好，則遠(yuǎn)期HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率和完全應(yīng)答率、持續(xù)應(yīng)答率高，病毒變異率低。其機(jī)理可能與健脾補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)Th9/Treg 相關(guān)，而機(jī)體免疫失衡后恢復(fù)正常對(duì)病毒的控制作用是藥物無(wú)法比擬的。本研究中兩組HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能與病例數(shù)少、觀察時(shí)間短等有關(guān)。因此，需要擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步探討健脾補(bǔ)腎中藥治療CHB 的療效及作用機(jī)理。

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