趙文靜 張淑芹 劉淑榮 葉東霞 劉 薇

吉林省肝膽病醫(yī)院科研室(吉林 長春，130062)

各種原因引起肝臟疾病進(jìn)展到終末期，常累及廣泛的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，造成肝功能失代償，最終導(dǎo)致肝功能衰竭［1］。對終末期肝病的治療臨床上主要以保肝對癥及預(yù)防并發(fā)癥為主，但總體治療效果并不理想，其病死率很高。目前原位肝移植仍然是其最有效的治療手段，但其存在供肝缺乏，移植后的免疫排斥反應(yīng)和高額的醫(yī)療費(fèi)用等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用［2］。研究表明，骨髓干細(xì)胞是肝細(xì)胞重要的肝外來源，在肝損傷和肝細(xì)胞再生的過程中，骨髓干細(xì)胞在特定的環(huán)境下可分化為肝干細(xì)胞和肝細(xì)胞，參與肝臟結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)和重建［4～8］。干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為終末期肝病的治療帶來了新的希望。我院在完成大量基礎(chǔ)研究和動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上于2010年5 月開展自體骨髓干細(xì)胞移植技術(shù)，現(xiàn)已采用此技術(shù)治療56 例終末期肝病患者，將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年5 月-2013年5 月間我院收治的終末期肝病患者56 例，男41 例，女15 例，年齡24～62 歲，其中46 例為乙型肝炎肝硬化，4 例為丙型肝炎肝硬化，4 例為酒精性肝硬化，2 例為原發(fā)性膽汁性肝硬化;肝硬化Child-Pugh 分級:A 級10例，B 級39 例，C 級7 例。診斷均符合2000年全國(西安)病毒性肝炎學(xué)術(shù)會議標(biāo)準(zhǔn)及肝功能衰竭診療指南和病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):患者年齡＜18 歲或＞65 歲;孕婦或哺乳期婦女;不愿提供知情同意者;合并腹腔、肺部或其他系統(tǒng)嚴(yán)重感染患者;心、肺、腎等重要臟器功能不全/衰竭患者;伴有嚴(yán)重的惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾病患者;合并如肝性腦病、上消化道大出血、肝腎綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥未控制患者;合并Ⅲ期高血壓，伴心、肝、腎并發(fā)癥之一的患者;伴有HIV 重疊感染患者;有酗酒或吸毒史患者;治療前1 周內(nèi)化驗(yàn)PTA ＜35%或有嚴(yán)重出血傾向;血常規(guī)檢測:WBC ＜4.0 ×109/L，PLT ＜50 ×109/L;過敏體質(zhì)等其他嚴(yán)重情況影響治療。本項(xiàng)目通過吉林省肝膽病醫(yī)院倫理委員會及新技術(shù)委員會審查批準(zhǔn)，并在上級衛(wèi)生主管部門備案，患者及家屬充分知情并簽署知情同意書。

1.2 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前經(jīng)治醫(yī)生認(rèn)真分析病歷，科主任主持科室醫(yī)生進(jìn)行術(shù)前討論，向患者或其家屬交代手術(shù)可能引發(fā)的危險(xiǎn)性及并發(fā)癥，保證患者及其家屬完全知情，同時(shí)簽署《自體骨髓干細(xì)胞采集術(shù)知情同意書》和《干細(xì)胞移植知情同意書》。術(shù)前患者檢測血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝功能、腎功能、凝血4 項(xiàng)，尿妊娠試驗(yàn)和肝臟儲備功能，行心電圖、胸片、腹部B 超，CT 等檢查。骨髓采集前兩天患者皮下注射集落細(xì)胞刺激因子100μg/d，qd，術(shù)前1 天行碘過敏實(shí)驗(yàn)。術(shù)前4 小時(shí)患者禁食禁水，雙側(cè)腹股溝常規(guī)備皮。

1.3 骨髓的采集和干細(xì)胞分離 骨髓采集穿刺點(diǎn)為兩側(cè)髂后上棘，局部麻醉，18 號骨穿刺針無菌操作采集骨髓200ml 左右，以2500U 枸櫞酸鈉抗凝。在萬級無菌室采用負(fù)收集法分離骨髓干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞試劑盒購自寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司。嚴(yán)格按照說明書操作分離干細(xì)胞，臺盼蘭拒染法檢測細(xì)胞活性，等滲鹽水稀釋到5ml，即進(jìn)行干細(xì)胞移植。

1.4 骨髓干細(xì)胞移植方法 患者局部麻醉，在X 光透視下，經(jīng)股動脈插管至肝固有動脈，注射造影劑，首先觀察肝內(nèi)血管情況及有無占位病變，將分離好的干細(xì)胞緩慢地注入肝內(nèi)，注射后用10ml 生理鹽水沖管，干細(xì)胞移植術(shù)后按照肝動脈導(dǎo)管治療術(shù)后常規(guī)護(hù)理，穿刺點(diǎn)加壓包扎，繃帶固定。

1.5 主要觀察指標(biāo)

1.5.1 肝臟儲備功能指標(biāo)檢測 注射用吲哚菁綠(ICG) (遼寧丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司);DDG-3300K 分析儀(日本光電工業(yè)株式會社)。采用PDD法測定患者治療前及治療12 周肝臟儲備功能，包括ICG 血 漿 清 除 率 (ICGK)、ICG15min 滯 留 率(ICGR15)。

1.5.2 肝臟合成功能指標(biāo)檢測 檢測患者治療前和治療1 周、4 周、8 周、12 周血清Alb、CHE、PT 等肝臟合成功能指標(biāo)。

1.5.3 干細(xì)胞移植術(shù)后肝臟超聲檢查 觀察患者治療前和治療4 周后患者的腹水情況以及肝臟內(nèi)是否有新生物或腫瘤樣異常病灶。

1.5.4 患者癥狀體征及不良反應(yīng)情況觀察 觀察患者干細(xì)胞移植治療術(shù)前后患者癥狀和體征，主要包括食欲、體力、肝病面容、蜘蛛痣及不良反應(yīng)，不良反應(yīng)主要包括發(fā)熱、穿刺部位出血和滲出等。

2 結(jié)果

2.1 患者骨髓采集和干細(xì)胞分離情況 患者骨髓采集量為120～180ml，分離細(xì)胞數(shù)為5.8 ×107～9.6 ×108，細(xì)胞存活率為96%～98%;相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為單一、較大圓形的單個(gè)核細(xì)胞(插頁圖1)。流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞占5.6%～9.8%。

2.2 患者干細(xì)胞移植后癥狀體征改善情況 自體骨髓干細(xì)胞移植術(shù)后1 周91.6% 的患者食欲改善，87.5%的患者體力明顯改善，移植術(shù)后兩周部分患者出現(xiàn)肝病面容好轉(zhuǎn)，術(shù)后4 周有4 例患者蜘蛛痣明顯減少。

2.3 患者自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后肝臟儲備功能指標(biāo)變化 56 例患者骨髓干細(xì)胞移植前及術(shù)后12周檢測肝臟儲備功能，ICGK 和ICGR15 治療后較治療前好轉(zhuǎn)，ICGK 由移植前的(0.0885 ±0.0533)/min 升高到(0.1438 ±0.0756)/min，治療前后比較差異有顯著性意義(P ＜0.05);ICGR15 由移植前的(32.01 ±19.56)%下降到(19.31 ±15.63)%，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

2.4 患者自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后肝臟合成功能指標(biāo)變化 自體骨髓干細(xì)胞移植術(shù)后1 周，Alb 無明顯變化，術(shù)后4 周開始升高，隨觀察時(shí)間延長逐漸升高，術(shù)后12 周達(dá)到最高值，與治療前比較差異有顯著性意義(P ＜0.05);CHE、PT 移植術(shù)后持續(xù)改善，12 周時(shí)較術(shù)前增加最明顯，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

表1 患者自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后肝臟儲備功能指標(biāo)變化（±s)

表1 患者自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后肝臟儲備功能指標(biāo)變化（±s)

與治療前比較，* P ＜0.05

2.5 患者自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后腹部超聲檢查結(jié)果 術(shù)后4 周18 例并發(fā)腹水患者中，有61.1%(11/18)腹水消失，27.8% (5/18)腹水減輕但沒有消退，術(shù)后4 周和12 周所有患者影像學(xué)檢查，肝臟部位均未發(fā)現(xiàn)新生物或腫瘤樣異常病灶。

2.6 患者自體骨髓干細(xì)胞移植后不良反應(yīng)情況 本研究干細(xì)胞移植成功率為100% (56/56)，術(shù)后患者無發(fā)熱、感染和白細(xì)胞下降等不良反應(yīng)，穿刺部位無出血及滲出。

3 討論

研究表明干細(xì)胞既有自我復(fù)制和高度增殖能力，又有多向分化潛能。體外研究與動物研究發(fā)現(xiàn)，骨髓干細(xì)胞在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下可分化為肝細(xì)胞［9，10］，同時(shí)在向肝細(xì)胞分化過程中釋放多種細(xì)胞因子，從而參與肝臟的修復(fù)。干細(xì)胞移植臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果從患者受損肝臟功能的恢復(fù)和肝臟再生兩方面證實(shí)了骨髓干細(xì)胞對肝臟的修復(fù)作用。馬代全等［11］觀察結(jié)果顯示骨髓干細(xì)胞植術(shù)后4 周，終末期肝病患者納差、乏力等癥狀明顯改善，77.50%患者停止輸注人血白蛋白及使用利尿劑，在隨訪時(shí)間內(nèi)未再出現(xiàn)腹水，術(shù)后1～6 個(gè)月血清Alb 較術(shù)前上升;兩個(gè)月后患者總膽紅素(TBil)水平較術(shù)前下降，與國內(nèi)學(xué)者潘興南的研究結(jié)果相似［12］。Terai 等［13］采用自體骨髓MSCs (多能干細(xì)胞)移植治療肝硬化患者，移植后24 周患者血清Alb 升高，Child-Pugh 評分顯著提高。

本研究采用自體骨髓干細(xì)胞移植治療56 例終末期肝病患者，采用的是患者自體骨髓源性干細(xì)胞，可一次性采集120～180ml 骨髓，體外可分離出大約5.8 ×107～9.6 ×108個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，滿足肝臟干細(xì)胞移植要求。體外分離純化后干細(xì)胞經(jīng)肝固有動脈植入患者肝內(nèi)。從治療后隨訪結(jié)果看，多數(shù)患者食欲和體力改善明顯，納差、乏力等癥狀消失，腹水消退，大多數(shù)患者在短期內(nèi)白蛋白升高，凝血功能改善，到移植后12 周，患者肝臟儲備功能較治療前好轉(zhuǎn)。研究結(jié)果表明自體骨髓干細(xì)胞移植治療終末期肝病，患者臨床癥狀改善出現(xiàn)得早，腹水消退快，有效改善肝性腦病;有效修復(fù)肝損傷、改善肝功能、凝血功能及肝臟儲備功能，提高患者的生存質(zhì)量。自體骨髓干細(xì)胞移植治療終末期肝病患者安全可行，無不良反應(yīng)。

我們的研究仍處在起步階段，尚有許多工作和技術(shù)難點(diǎn)需要解決，如干細(xì)胞的最佳移植途徑、移植數(shù)量、移植細(xì)胞的長遠(yuǎn)功能，均是關(guān)鍵性問題。如何促進(jìn)移植干細(xì)胞向肝細(xì)胞完全意義上的轉(zhuǎn)化、以便更有效地改善病變肝組織的結(jié)構(gòu)和功能是今后研究的重中之重。

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