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(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心生物安全評價研究所,國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150076; 2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品加工研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

《本草綱目》記載,大豆有涂癰腫、逐水脹、長肌膚、填骨髓等作用。從豆渣中提取的可溶性大豆多糖具有許多生物學(xué)功能,目前主要用于食品行業(yè)的研究與應(yīng)用,本課題組經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)大豆多糖能增強荷瘤小鼠B淋巴細胞和T淋巴細胞的免疫功能,調(diào)節(jié)機體免疫功能抑制腫瘤細胞的生長[1 - 2]。且大豆多糖為植物中提取的活性物質(zhì)本身無毒、安全,有一定的生物學(xué)作用[3 - 5]。

環(huán)磷酰胺為臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物,由于其對造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的毒副作用不利于機體的繼續(xù)治療與術(shù)后的恢復(fù)[6 - 8],已有研究表明大豆多糖能通過提高機體免疫力,起到抗腫瘤作用,本研究將大豆多糖和環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用,腋下接種S180肉瘤的KM小鼠為載體,研究其對荷瘤機體免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的影響,以期既能夠開發(fā)臨床抗腫瘤輔助用藥,又能為環(huán)磷酰胺的安全使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

昆明種小鼠,18 ～ 22g,雌、雄各半 由長春高新醫(yī)學(xué)實驗動物研究中心提供;肉瘤S180購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院;大豆多糖(純度95%) 上海百奧特植物蛋白科技有限公司;環(huán)磷酰胺(CP) 江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司;Anti - mouse - FITC - CD4單克隆抗體、Anti - mouse - PE - CD8單克隆抗體 美國ebioscience公司;小鼠腫瘤壞死因子 - αELISA 檢測試劑盒 美國R&D公司等。

ALC - 110. 4型萬分之一電子天平 德國Sartorius Group;LD4 - 2A型臺式低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠;普通光學(xué)顯微鏡 Leica公司;SUNRISE 酶標(biāo)儀 TECAN公司;EPICS - XL - MCL流式細胞儀 美國Beckman - Coulter公司等。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 動物分組與給藥 昆明種小鼠50只,將接種8d的S180肉瘤腹水5mL,生理鹽水1∶ 3稀釋,0. 2mL/只接種于小鼠右前肢腋下。24h后隨機分成5組,每組10只,雌雄各半。從接種第二天開始,分別腹腔注射給藥,分為陰性對照組:同體積生理鹽水;環(huán)磷酰胺(CP)對照組:25mg/(kg·d);大豆多糖(soybean polysaccharide,SPS)聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組A:CP 25mg/kg·d+SPS 50mg/kg·d、B:CP 25mg/(kg·d)+SPS 100mg/(kg·d)、C:CP 25mg/(kg·d)+SPS 200mg/(kg·d);給藥量為0. 2mL/只/d,連續(xù)給藥10d,停藥次日處死動物。

1. 2. 2 白細胞懸液制備 停藥次日,試管內(nèi)加2%的乙酸0. 38mL,取0. 02mL尾靜脈血,充分裂解紅細胞,顯微鏡下觀察外周血白細胞數(shù)量。

1. 2. 3 脾淋巴細胞制備 收集脾細胞于離心管中,以1500r/min離心10min。10倍體積0. 83%的NH4Cl溶液重懸,靜置4min,裂解紅細胞,1000r/min離心5min得白細胞液。Hanks液洗,pH為7. 2 ～ 7. 4的PBS稀釋細胞成1×106個/mL。

1. 2. 4 小鼠血清中TNF - α的檢測 眼球取血,1000r/min離心10min,取50μL加生物素標(biāo)記抗體50μL。37℃溫育1h。加親和鏈酶素 - HRP 60μL,37℃溫育30min。每孔加入底物A和底物B各50μL,37℃溫育10min。450nm波長處測定各孔的OD值。以TNF - α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算各樣品中的TNF - α含量。

1. 2. 5 T淋巴細胞亞群的測定 取1×106個細胞1mL,2000r/min離心5min,分別加入熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8的單克隆抗體各100μL,同時設(shè)空白對照組和單加CD4、CD8抗體的對照組。4℃避光30min,加1mL PBS緩沖液洗滌,2000r/min離心5min,1% 多聚甲醛1mL固定30min,200目過濾,流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)量的影響

由表1可以看出,環(huán)磷酰胺顯著(p<0. 01)降低了荷瘤小鼠血液中的白細胞數(shù)量,與環(huán)磷酰胺組相比,大豆多糖各劑量組白細胞數(shù)量均有極顯著(p<0. 01)上升。

表1 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)量的影響Table 1 The effect of SPS with CP on WBC of mice

注:與對照組比較*p<0. 05,* *p<0. 01;與CP比較#p<0. 05;##p<0. 01。

2. 2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠血清中TNF - α含量的影響

TNF - α標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0. 002x+0. 118,R2=0. 993

圖1 TNF - α標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of TNF - α

如表2所示,與對照組相比,環(huán)磷酰胺組TNF - α水平下降,差異極顯著(p<0. 01),聯(lián)合用藥各劑量組TNF - α含量均有所提高,其中低劑量組統(tǒng)計學(xué)無意義(p>0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。與環(huán)磷酰胺組比較,低劑量組有差異(p<0. 05),中、高劑量組有極顯著性差異(p<0. 01)。

2. 3 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠 T 淋巴細胞亞群的影響

表2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠血清TNF - α含量的影響Table 2 The effect of SPS with CP on TNF - α in serum of mice with tumor

圖2 大豆多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺對S180荷瘤小鼠T淋巴細胞亞群作的影響Fig. 2 The effect of SPS with CP on and of T lymphocyte subsets注:a:對照組;b:環(huán)磷酰胺組;c:低劑量組;d:中劑量組;e:高劑量組。

3 討論

腫瘤治療主要根據(jù)腫瘤細胞和正常細胞不同的代謝特征、生物學(xué)特征、基因特征進行的,如果只強調(diào)治療腫瘤的個性,忽視共性和整體原則就會影響治療效果。如化療及放療藥物在殺死腫瘤細胞的同時也損壞機體的免疫功能,使殘存的腫瘤細胞急劇繁殖,影響治療效果。臨床觀察表明惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,患者對治療措施的療效和存活期與機體的免疫狀態(tài)有密切關(guān)系。因此通過提高機體的免疫功能增強機體抗腫瘤作用的治療方法也越來越重要。天然多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑由于本身對機體的毒副作用小,增強機體免疫力等優(yōu)點受到人們的密切關(guān)注[9]。 造血系統(tǒng)是體內(nèi)高度活躍和高度新陳代謝的系統(tǒng),由于血細胞的生成主要是在骨髓造血組織中進行,因此血細胞的變化能夠一定程度的反映骨髓造血系統(tǒng)的變化。環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致機體外周血白細胞數(shù)量減少,T細胞異常活化,使免疫功能低下,是化療藥物骨髓抑制的表現(xiàn)[10]。TNF - α能夠引起腫瘤組織血管損傷和血栓形成,繼而使腫瘤組織發(fā)生出血、壞死,并能夠促進T細胞及其它殺傷細胞對腫瘤細胞進行殺傷。

4 結(jié)論

[1]張秀娟,劉斌,孫宇婷,等. 大豆多糖對S180荷瘤小鼠抗腫瘤作用的免疫機制研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(2):389 - 392.

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