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(哈爾濱商業(yè)大學,食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

α - 亞麻酸(α - Linolenic acid)即9,12,15 - 十八碳三烯酸,它是一種高級多不飽和脂肪酸,分子式為CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH[1]。它以甘油酯的形式存在于亞麻籽油、蘇子油等干性油中,為淡黃色液體,熔點 - 11. 3℃,沸點230 ～ 232℃(17mmHg),相對密度0. 9164,可溶于乙醇和乙醚。α - 亞麻酸是一種人體自身無法合成的必需脂肪酸,它是維系人類腦進化的核心物質(zhì),到達α - 亞麻酸代謝的歷程終端,將形成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,即EPA和DHA[2],這兩者都是神經(jīng)細胞膜的重要組成成分。其中,EPA具有降低血脂和改善血小板凝固的作用,可預防腦血栓和心肌梗塞等疾病。自上個世紀80年代以來被公認為人類有效的保健食品之一。而DHA則具有促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、視網(wǎng)膜反射能力和提高記憶力、預防癌癥、預防老年癡呆癥和抗過敏癥等功效[3]。

近年來,β - 環(huán)糊精包合技術的主要原理是利用物質(zhì)擴散至β - 環(huán)糊精的空穴中,形成環(huán)糊精的包合進行純化,它可與許多無機、有機分子結合成主客體包合物,并能改變被包合物的化學及物理性質(zhì),具有穩(wěn)定、保護、增溶客體分子和選擇性定向分子的特性[4],因而β - 環(huán)糊精包合技術在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、高分子合成、化妝用品以及化學檢測等方面都有廣泛的應用[5]。利用環(huán)糊精包埋復合物的研究趨于成熟,并開始在某些領域得到應用。環(huán)糊精最常見的主要有環(huán)糊精α、β、γ三種,其中β - 環(huán)糊精應用最為廣泛[6]。不管是在國外還是國內(nèi)市場,α - 亞麻酸都具有廣泛需求,且人們對其進行提取、純化的方法具有多樣性[7]。因此,本實驗對β - 環(huán)糊精包合法純化混合脂肪酸中α - 亞麻酸的工藝條件進行優(yōu)化,利用響應曲面法進一步優(yōu)化提取方法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

亞麻籽油 市售;無水乙醇 分析純,天津市天力化學試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,黑龍江阿城化學試劑廠;鹽酸 優(yōu)級純,哈爾濱新達化工廠;無水乙醚 分析純,天津市富宇精細化工有限公司;無水硫酸鈉 分析純,天津塘沽鄧中化工廠;β - 環(huán)糊精 天津市光復精細化工研究所;混合脂肪酸 亞麻籽油提取得到。

DK - 98 - 1型電子恒溫水浴箱 天津市泰斯特儀器有限公司;ALC - 1100. 2型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;便攜式pHS - 3C型數(shù)字精密pH計 中國上海儀器廠;TU - 1900型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;R - 205型旋轉蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術有限公司;MC型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHG - 9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;KQ - 500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 α - 亞麻酸定量分析實驗

1. 2. 1. 1 標準曲線的繪制 分別取不同體積濃度為為0. 2mg/mL的α - 亞麻酸標準溶液,定容至25mL。分別于最大吸收波長處測其吸光值,以α - 亞麻酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,最大吸收波長下的吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

1. 2. 1. 2 α - 亞麻酸含量的測定 α - 亞麻酸的含量計算方程如下:

注:W- α - 亞麻酸含量/%;m- 富含α - 亞麻酸的質(zhì)量/g;M- 亞麻油混合脂肪酸的質(zhì)量/g。

1. 2. 2 β - 環(huán)糊精包合法提取α - 亞麻酸單因素實驗

1. 2. 2. 1 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量的熱水配成飽和溶液,在恒溫條件下,分別攪拌至規(guī)定溫度(30、40、50、60、70℃),然后分別加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合液,恒溫攪拌2h,冷卻后置于冰箱中冷凍18h,待溶化后抽濾洗滌,置于80℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥3h后,得到白色粉末狀α - 亞麻酸 - β - 環(huán)糊精包合物。將包合物置于燒瓶中,加適量乙醚,在40℃恒溫水浴鍋中回流1h,減壓抽濾回收乙醚,即得富含α - 亞麻酸的脂肪酸[8]。

1. 2. 2. 2 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量分別為2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇配成混合溶液。按照β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)的不同比例,分別稱取一定量(12、15、18、21、24g)的β - 環(huán)糊精,在恒溫條件下攪拌至50℃后,加入混合液恒溫攪拌2h,冷卻后置冰箱冷凍18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 3 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量熱水配成飽和溶液,在恒溫條件下攪拌至50℃,分別加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合液,恒溫攪拌一定時間(1、1. 5、2、2. 5、3h),冷卻后置冰箱中冷凍18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 4 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量熱水配成飽和溶液,恒溫攪拌至50℃后,加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合溶液,恒溫攪拌2h,冷卻后置于冰箱中冷凍一定時間(6、12、18、24、30h)后,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 3 響應曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸提取工藝條件 采用Box - Behnken模型,以包合溫度、包合時間和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比三個單因素為影響α - 亞麻酸含量的主要考察因子(自變量),分別以x1、x2、x3表示,并以 - 1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平,按方程xi=(xi- xo)/x對自變量進行編碼。其中xi為自變量的編碼值,Xi為自變量的真實值,xo為實驗中心點處自變量的真實值,x為自變量的變化步長,因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析,擬合二次多項式回歸模型的Box -Behnken設計實驗[9 - 10],進行結果分析,得到β - 環(huán)糊精包合法分離亞麻油中α - 亞麻酸的優(yōu)化工藝條件。

2 結果與討論

2. 1 α - 亞麻酸定量分析

標準曲線的繪制結果:在300nm下測定不同濃度α - 亞麻酸標樣的吸光值,擬合得回歸方程:y=0. 0047x+0. 0804(R2=0. 9973),有效線性范圍:70 ～310μg/mL,繪制標準曲線見圖1。

圖1 α - 亞麻酸標準曲線Fig. 1 The standard curve of α - linolenic acid

2. 2 β - 環(huán)糊精包合法提取α - 亞麻酸單因素實驗

2. 2. 1 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響 從圖2中可以看出,隨著包合溫度在30 ～ 60℃之間逐步上升,α - 亞麻酸的含量顯示出逐漸增加的趨勢,這是因為β - 環(huán)糊精包合物的形成是一個吸熱過程,溫度增高時,反應向生成β - 環(huán)糊精包合物的方向進行,包合溫度隨不飽和度的增加而增加,包合溫度的增長有利于不飽和脂肪酸與β - 環(huán)糊精形成包合物。當溫度高于60℃時,β - 環(huán)糊精的包合能力開始下降,α - 亞麻酸的含量開始降低。由此可見,包合溫度為60℃時,提取效果最佳,α - 亞麻酸的含量為38. 4%。

圖2 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 2 The effect of bonding temperature to α - linolenic acid content

2. 2. 2 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響結果與分析 從圖3中可以看出,在1 ～ 2h之間,α - 亞麻酸的含量呈上升趨勢,即隨著包合時間的延長,更有利于不飽和脂肪酸與β - 環(huán)糊精形成包合物。當包合時間為2h時,β - 環(huán)糊精與不飽和脂肪酸達到了最佳的包合狀態(tài),此時提取效果最好,α - 亞麻酸的含量為50. 8%,之后隨著時間的增加,β - 環(huán)糊精失去了包合的能力,開始不再對不飽和脂肪酸進行包合,α - 亞麻酸的含量也開始逐漸降低,由此可見,2h為α - 亞麻酸的最佳包合時間。

圖3 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 3 The effect of inclusion time to α - linolenic acid content

2. 2. 3 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響結果與分析 從圖4中可以看出,當β - 環(huán)糊精的用量在12 ～ 21g之間增加時,α - 亞麻酸的含量也在逐漸增加,這是由于β - 環(huán)糊精包合不飽和脂肪酸的能力在不斷增強,直到其達到最佳的包合程度,此時,β - 環(huán)糊精用量為21g時,α - 亞麻酸的含量為51. 5%。但是,當β - 環(huán)糊精用量超過21g之后,β - 環(huán)糊精包合能力開始下降,這時α - 亞麻酸的含量也開始下降。這是由于β - 環(huán)糊精與液體的用量比不隨溫度或在加成前其他組份的濃度而變化,β - 環(huán)糊精與脂肪酸的比隨脂肪酸的飽和度不同而不同。

圖4 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 4 The effect of β - cyclodextrin dosage to α - linolenic acid content

2. 2. 4 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響結果與分析 從圖5中可以看出,在相同條件下,隨著冷凍時間的延長,有利于β - 環(huán)糊精對不飽和脂肪酸的包合,在6 ～ 18h之間,α - 亞麻酸的含量一直在增加,當冷凍時間增加到18h時,具有最佳的提取效果,α - 亞麻酸的含量為47. 8%,此時,β - 環(huán)糊精對不飽和脂肪酸的包合能力已達到極限。之后隨著冷凍時間的增加,β - 環(huán)糊精包合能力下降,α - 亞麻酸的含量逐漸下降。由此可以得出結論:18h為α - 亞麻酸的最佳冷凍時間。

圖5 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 5 The effect of freeze time to α - linolenic acid content

2. 3 響應曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸提取工藝條件結果與分析

2. 3. 1 回歸模型的建立 經(jīng)過對包合溫度、包合時間、β - 環(huán)糊精用量以及冷凍時間四個因素進行方差分析,得出:冷凍時間對α - 亞麻酸的含量沒有顯著性的影響,因此,在接下來的響應曲面實驗中將不再將冷凍時間作為主要因素加以考慮。

利用Design Expert軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得β - 環(huán)糊精法提取α - 亞麻酸的包合溫度(x1)、包合時間(x2)和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比(x3)的二次多項回歸模型方程為:

Y=69. 74 - 0. 62x1+2. 72x2+1. 96x3- 0. 93x1x2+0. 24x1x3+0. 49x2x3- 1. 28x12- 2. 64x22- 9. 43x32

2. 3. 2 方差分析 通過Design - Expert軟件進行誤差分析,以驗證模型的顯著性,結果見表4及表5。

表3 實驗設計與結果表Table 3 Design and results of experiment

表4 響應面模型方差分析表Table 4 Response surface model analysis of variance table

注:p<0. 0001 極顯著,p<0. 05顯著,表5同。

從表5回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知,模型一次項x2、x3極顯著,x1顯著;交互項x1x2、x2x3顯著,x1x3不顯著;二次項x12、x22、x32均極顯著。

2. 3. 3 α - 亞麻酸質(zhì)量濃度的響應面分析

2. 3. 3. 1 包合溫度與包合時間交互作用 由圖6可知,在β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量比值為最佳值7. 14∶ 1時,包合溫度與包合時間對α - 亞麻酸含量的交互影響效應。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著。其中,包含溫度對α - 亞麻酸含量的影響不大;而隨著包合時間的增加,α - 亞麻酸的含量逐步提高,當包合時間較短時,α - 亞麻酸的含量包合時間的增加而增大,但當包合時間超過2. 18h時,α - 亞麻酸的含量隨包合時間的增加而減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度和包合時間分別在59 ～ 61℃和1. 5 ～ 2. 5h范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達到實驗中的最大值。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Significance test of the regression equation coefficients

圖6 包合溫度、包合時間及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應曲面Fig. 6 Influence of bonding temperature,inclusion time and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 3. 2 包合溫度與β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比交互作用 由圖7可知,在包合時間為最佳值2. 18h時,包合溫度與β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)對α - 亞麻酸含量的交互影響效應。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用不顯著。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度對α - 亞麻酸的含量的影響不大。當β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比較低時,α - 亞麻酸的含量隨β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比的增大而增大,但當包合溫度超過59. 71℃時,α - 亞麻酸的含量隨β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比的增大而減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比分別在59 ～61℃和6∶ 1 ～ 8∶ 1范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達到實驗中的最大值。

2. 3. 3. 3 包合時間與β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比交互作用 由圖8可知,在包合溫度為最佳值59. 71℃時,包合時間與β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)對α - 亞麻酸含量的交互影響效應。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著。隨著β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比值的增加,α - 亞麻酸的含量也逐步提高,當β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比值超過7. 14∶ 1時,α - 亞麻酸的含量開始減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合時間和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的比值分別在1. 5 ～ 2. 5h和6∶ 1 ～ 8∶ 1的范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達到實驗中的最大值。

圖7 包合溫度、β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應面Fig. 7 Influence of bonding temperature,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

圖8 包合時間、β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應面Fig. 8 Influence of inclusion time,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 4 驗證實驗結果分析 根據(jù)回歸方程及上述分析,響應面存在最大值,可得α - 亞麻酸純化的最佳工藝條件,即:包合溫度59. 71℃,包合時間2. 18h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1,得到α - 亞麻酸的含量為71. 47%。優(yōu)化此工藝條件,即:包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1,采用此工藝做驗證實驗,結果如表6所示。

表6 回歸模型驗證實驗結果表Table 6 Table results of test model

由表6可看出,采用此工藝條件進行驗證實驗,得到α - 亞麻酸的含量為71. 45%,與理論值相差不大,因此確定最佳工藝條件為包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1。

3 結論

以亞麻籽油為原料,研究β - 環(huán)糊精包合法純化α - 亞麻酸的最佳工藝條件。通過紫外譜掃描確定α - 亞麻酸的最大波長為300nm。通過單因素實驗確定α - 亞麻酸的最佳純化工藝條件:即包合溫度60℃,包合時間2h,β - 環(huán)糊精用量21g,冷凍時間18h為最優(yōu)條件。通過響應曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸的提取純化工藝條件:即包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量比為7. 14∶ 1的數(shù)據(jù)結果顯著,得到α - 亞麻酸的含量為71. 45%。

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