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(1. 重慶工商大學(xué)催化與功能有機(jī)分子重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400067； 2. 重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,重慶 400067)

肉的腌制過(guò)程可對(duì)肉起到一定程度的嫩化作用[1]。肉的酸漬腌制過(guò)程可通過(guò)將肉浸泡在乳酸、醋酸和果汁酸等一些酸液中進(jìn)行[2]。研究認(rèn)為,酸腌制對(duì)肉的嫩化可能是由于肉在腌制過(guò)程中由于膨脹導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)的弱化,組織蛋白酶對(duì)蛋白的降解變化以及在結(jié)合蒸煮過(guò)程中,在較低的pH下,膠原蛋白發(fā)生凝膠化變化所致[3]。

膠原蛋白是構(gòu)成肉中肌內(nèi)結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在肌原纖維形成肌束和骨骼肌的過(guò)程中,以及在肌肉運(yùn)動(dòng)過(guò)程中對(duì)力的維持、傳遞起到極其重要的作用[4]。肌肉膠原蛋白由肌束膜膠原蛋白和肌內(nèi)膜膠原蛋白兩種構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn),在肉制品加工過(guò)程中膠原蛋白熱力學(xué)特性變化對(duì)其品質(zhì)起到一定的影響作用[5]。研究表明,畜禽肌肉品質(zhì)在一定程度上受到肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白特性的影響,包括其含量、溶解性以及熱收縮溫度等[4]。目前,未見有弱有機(jī)酸結(jié)合NaCl腌制對(duì)肌內(nèi)肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量及熱力特性的研究報(bào)道。

本研究以牛半腱肌肉為材料,乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl為腌制劑,探討不同腌制對(duì)牛肉中肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白熱力特性的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討,從而為肉類腌制產(chǎn)品的加工及肉類嫩化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

牛半腱肌 選擇來(lái)自同一育肥場(chǎng)、品種和飼養(yǎng)管理相同的土種黃牛的改良后代(西門塔爾×南陽(yáng)黃牛)公牛5頭,屠宰后牛半胴體在4℃冷庫(kù)中成熟48h后進(jìn)行取樣,從半胴體上取下整條半腱肌,所選胴體其大理石花紋、生理成熟度和背膘厚度等指標(biāo)基本相似,然后分割成2. 5cm厚肉塊若干個(gè)；乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl均為食品級(jí)(國(guó)產(chǎn))；其它所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MC - DSC差示掃描量熱儀 美國(guó)TA Instrument公司;AllegraTM64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman - Coulter公司;Alpha2 - 1. 2冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ;Ultra - Turrax T25 BASIC高速勻漿器 德國(guó)Ika -Werke公司;直插式pH計(jì) 英國(guó)Thermo Scientific公司;ZKSY - 600智能恒溫水箱 南京科爾儀器設(shè)備有限公司;Shimadzu AUY120電子天平 日本島津公司;GBF - C - 321型雪皇冷藏柜 杭州偉龍制冷設(shè)備有限公司;78 - 1型磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 腌制處理 將牛半腱肌肉(pH在5. 6 ～ 5. 8之間)分割成2. 5cm×5. 0cm×5. 0cm大小的肉塊(約(100±5)g)若干,隨即分組并稱重,置于下列弱有機(jī)酸和NaCl的不同組合腌制劑中,于4℃條件下浸泡腌制24h,其中不經(jīng)腌制處理的作為對(duì)照組。腌制處理組分別為:2% NaCl,1. 5%乳酸,1. 5%乳酸+2% NaCl,1. 5%醋酸,1. 5%醋酸+2% NaCl,1. 5%檸檬酸,1. 5%檸檬酸+2% NaCl。每組腌制共6小塊肉樣,肉樣與腌制液之比為1∶ 5(g/mL)。腌制完成后,用吸水紙吸干肉塊表面水分,稱重后進(jìn)行真空包裝,于4℃貯藏待分析。

1. 2. 2 肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白提取 腌制處理前后肉樣肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白的提取參照Chang等[4]、Li等[6]和常海軍等[7]方法,并作了部分修改。具體方法如下:取40g肉樣(濕重),切成約為1cm3的肉丁,加入50mL預(yù)冷的CaCl2(50mmol/L),用高速勻漿器在4000r/min絞碎20s,經(jīng)尼龍網(wǎng)(100目)過(guò)濾,濾渣用40mL預(yù)冷的50mmol/L CaCl2于4000r/min絞碎10s,再過(guò)濾,上述過(guò)程再重復(fù)2次。濾渣主要成分是肌束膜,合并濾液(主要含肌內(nèi)膜)。肌束膜組分用1% SDS溶液于室溫下洗20min,靜置后棄上清(去除非蛋白成分),重復(fù)洗三次。沉淀放入透析袋于4℃蒸餾水中透析24h,除去SDS,再在40%甲醇溶液中透析24h,最后在蒸餾水中透析24h,去除甲醇,純化后的肌束膜經(jīng)真空冷凍干燥后稱重,其含量以占樣品濕重的百分比計(jì)算。

上述得到的濾液在4℃下靜置24h,棄上清。沉淀中加入提取緩沖液(25mmol/L NaCl,2. 5mmol/L組氨酸,pH7. 4)[8],室溫下攪拌5min,于3000r/min離心15min,去上清,重復(fù)操作三次,后續(xù)透析純化同上述肌束膜的純化操作一致。

1. 2. 3 肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白DSC分析 經(jīng)分離提取后的肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白用差示掃描量熱儀(DSC)分析其熱量變化(用量5. 0mg),溫度掃描范圍為20 ～ 100℃,升溫速率2℃/min,用TA instrument自帶分析軟件(Universal Analysis 2000)對(duì)熱流變化曲線進(jìn)行分析,計(jì)算樣品熱變性溫度。

1. 3 數(shù)據(jù)分析處理

運(yùn)用SPSS16. 0一般線性模型(GLM)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析、LSD多重比較以及相關(guān)性分析。各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值測(cè)定重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2. 1 牛肉腌制處理過(guò)程中肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量的變化

由圖1可見,牛肉經(jīng)不同腌制處理后,與對(duì)照組相比,部分處理組肌束膜膠原蛋白含量降低,尤其表現(xiàn)為NaCl、三種不同有機(jī)酸的單獨(dú)腌制處理。而不同腌制劑的結(jié)合腌制處理其肌束膜膠原蛋白含量較單獨(dú)腌制處理高,而與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。而肌內(nèi)膜膠原蛋白含量在不同腌制處理組之間存在顯著或極顯著差異。

圖1 三種弱有機(jī)酸和NaCl結(jié)合腌制過(guò)程中牛肉肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量的變化Fig. 1 Changes in perimysial and endomysial portion contents of intramuscular connective tissue from beef muscle following marination treatment注:不同大寫字母表示差異極顯著(p<0. 01); 不同小寫字母表示差異顯著(p<0. 05)。

肌束膜和肌內(nèi)膜是構(gòu)成肌肉結(jié)締組織的主要成分,Light等[9]認(rèn)為肌束膜膠原蛋白對(duì)肉嫩度的影響大于肌內(nèi)膜膠原蛋白,結(jié)締組織的量主要由肌束膜決定,而肌內(nèi)膜起次要作用。牛肉肌束膜含量在單獨(dú)腌制劑腌制處理過(guò)程中較對(duì)照組降低,可能是由于在此過(guò)程中肌束膜膠原蛋白發(fā)生變性以及凝膠化轉(zhuǎn)化所致。本研究結(jié)果顯示,不同腌制劑的結(jié)合處理一定程度上阻礙了這種變化,其原因可能與不同腌液的pH以及離子強(qiáng)度有關(guān)[10]。

2. 2 腌制處理過(guò)程中牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機(jī)酸結(jié)合NaCl腌制過(guò)程中,牛肉肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白DSC熱流曲線如圖2所示。

圖2 腌制過(guò)程中牛肉肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白差示掃描量熱分析熱流曲線Fig. 2 DSC heat flow curve for perimysial and endomysial collagen of beef muscle following marination treatment注:A. 肌束膜膠原蛋白熱流曲線;B. 肌內(nèi)膜膠原蛋白熱流曲線。

三種弱有機(jī)酸和NaCl結(jié)合腌制過(guò)程中牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化如圖3所示。

圖3 經(jīng)腌制處理后牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化Fig. 3 Changes in thermal shrinkage temperatures of perimysium collagen of beef muscle following marination treatment

由圖3可知,在腌制處理過(guò)程中,牛肉肌束膜膠原蛋白3種不同的變性溫度(To變性起始、Tp最大和Te終止溫度)變化趨勢(shì)一致。相比對(duì)照組而言,NaCl、檸檬酸以及NaCl和檸檬酸結(jié)合腌制組牛肉肌束膜膠原蛋白熱穩(wěn)定性變化較小,而乳酸、醋酸以及分別與NaCl結(jié)合腌制組牛肉肌束膜膠原蛋白變性溫度有所升高。

To為結(jié)締組織膠原蛋白熱變性起始溫度,反映膠原蛋白的最低熱穩(wěn)定性,Tp為最大熱變性溫度,反映膠原蛋白的一般熱穩(wěn)定性,通常用最大熱變性溫度的大小來(lái)反映膠原蛋白的熱穩(wěn)定特性[10 - 11]。在乳酸、醋酸以及分別與NaCl的結(jié)合腌制處理中,牛肉肌束膜膠原蛋白的熱變性溫度增加,表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。另外,研究發(fā)現(xiàn),上述處理組中肌肉肌內(nèi)β - 半乳糖苷酶和β - 葡糖醛酸酶活力都下降,所以對(duì)結(jié)締組織基質(zhì)蛋白多糖的水解程度降低,膠原蛋白熱穩(wěn)定性增加[12]。

2. 3 腌制處理過(guò)程中牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機(jī)酸結(jié)合NaCl不同腌制劑處理過(guò)程中牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白熱力特性的變化見圖4。

圖4 經(jīng)腌制處理后牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白熱力特性的變化Fig. 4 Changes in thermal shrinkage temperatures of endomysium collagen of beef muscle following marination treatment

由圖4可見,經(jīng)腌制處理后牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白Tp和Te溫度較對(duì)照組都有所增加。結(jié)合圖3和圖4可知,三種弱有機(jī)酸和NaCl結(jié)合腌制過(guò)程中牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白熱穩(wěn)定性較肌束膜膠原蛋白高,且腌制處理增強(qiáng)了肌內(nèi)膜膠原蛋白的穩(wěn)定性。

Bailey等[13]報(bào)道哺乳動(dòng)物膠原蛋白的最大熱變性溫度為65℃左右,但對(duì)不同的動(dòng)物屬種和肌肉類型也有差別。有研究報(bào)道,在DSC分析過(guò)程中,分析參數(shù)設(shè)置的不同(如溫度掃描范圍、升溫速率等)以及所分析樣品本身的特性都會(huì)影響到結(jié)果[11]。本研究中,肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白雖經(jīng)純化分離,但由于腌制處理過(guò)程中,不同腌制液pH以及離子強(qiáng)度的影響,部分處理組肌原纖維和膠原纖維發(fā)生變性,導(dǎo)致分離純化過(guò)程中可能還含有極少量的肌原纖維成分,另外,肌束膜和肌內(nèi)膜耐受腌制處理影響程度表現(xiàn)不一致,即受破壞程度不同,二者共同決定了肌肉結(jié)締組織膠原蛋白的熱力特性。由本結(jié)果可見,肌內(nèi)膜膠原蛋白的熱穩(wěn)定對(duì)其總體影響較大。

有報(bào)道稱分離提純后的熱不溶性膠原蛋白經(jīng)乳酸和醋酸處理可以降低其熱變性溫度[14],與本研究結(jié)果相反,可能原因是由于不同處理樣品所致,本實(shí)驗(yàn)中是模擬加工工藝中采用整塊肉塊腌制,另外,經(jīng)腌制處理后提取的肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白較熱不溶性膠原蛋白(結(jié)締組織濾渣成分)穩(wěn)定性差。

2. 4 相關(guān)性分析

在牛肉腌制處理過(guò)程中,對(duì)肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量以及熱力特性之間的相關(guān)性分析見表1。

表1 經(jīng)腌制處理后牛肉肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白熱力特性變化相關(guān)性分析Table 1 Correlation between thermal characteristic changes of perimysium and endomysium portion collagen following marination treatment

注:PC. 肌束膜膠原蛋白含量;EC. 肌內(nèi)膜膠原蛋白含量;P - Tp.肌束膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度);E - Tp. 肌內(nèi)膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度);* *. 相關(guān)系數(shù)雙尾檢驗(yàn)極顯著(p<0. 01)。

由表1相關(guān)性分析可知,肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量與其熱穩(wěn)定性之間相關(guān)性不顯著,而肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度)之間呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0. 262。

3 結(jié)論

牛肉經(jīng)三種弱有機(jī)酸(乳酸、醋酸和檸檬酸)以及和NaCl的結(jié)合腌制處理使得肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量和熱力特性發(fā)生了一定程度的變化。與對(duì)照組相比,NaCl以及三種不同有機(jī)酸的單獨(dú)腌制處理組肌束膜膠原蛋白含量降低,不同腌制劑的結(jié)合腌制處理其肌束膜膠原蛋白含量較單獨(dú)腌制處理高。牛肉肌內(nèi)膜膠原蛋白含量在不同腌制處理組之間有顯著差異。腌制處理增加了肌內(nèi)膜膠原蛋白和部分處理組肌束膜膠原蛋白的熱變性溫度,表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。結(jié)合前期研究表明,腌制處理過(guò)程中,牛肉肌束膜和肌內(nèi)膜膠原蛋白含量以及熱穩(wěn)定性等的變化對(duì)肉嫩度和質(zhì)構(gòu)等食用品質(zhì)特性產(chǎn)生顯著影響。

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