楊茜

摘 要：在目前制藥領(lǐng)域，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物取得了積極進(jìn)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)藥物以其具有與天然蛋白質(zhì)相似的特性而取得了重要應(yīng)用。從蛋白質(zhì)藥物制造技術(shù)發(fā)展來看，考慮到哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量較高，并且制備過程難度低、制備成本不高，由此決定了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物將在未來的制藥領(lǐng)域取得全面發(fā)展和應(yīng)用?；谶@一認(rèn)識(shí)，我們應(yīng)認(rèn)真總結(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物取得的進(jìn)展，并深入探討哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物技術(shù)的發(fā)展前景，做好哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物的研制工作。

關(guān)鍵詞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞；培養(yǎng)制備；充足蛋白質(zhì)藥物；進(jìn)展分析

1 前言

在近年生物制藥發(fā)展中，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)已經(jīng)成為了重要的發(fā)展方向。研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備的蛋白質(zhì)，無論是在制備質(zhì)量上，還是在蛋白質(zhì)含量上，都達(dá)到了藥用標(biāo)準(zhǔn)，并且在性能上也與天然蛋白質(zhì)較為接近?；谶@一優(yōu)勢和特點(diǎn)，關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物的研究得到了有效開展，并取得了積極的研究效果。結(jié)合目前關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物的現(xiàn)狀，該研究在重組細(xì)胞系、重組表達(dá)載體和生物制備過程中取得了積極進(jìn)展。

2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物在重組細(xì)胞系中取得的進(jìn)展

COS細(xì)胞曾是進(jìn)行外源基因表達(dá)研究中用途最廣的宿主，但由于其嚴(yán)重的貼壁作用，限制了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的實(shí)際應(yīng)用。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白中，常用的細(xì)胞系有CHO和HEK293兩大類細(xì)胞。CHO是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞。該細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，本身很少分泌內(nèi)源蛋白，因此對(duì)目標(biāo)蛋白分離純化工作十分有利，是表達(dá)復(fù)雜生物大分子的理想宿主。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞及CHO/dhfr-細(xì)胞，被廣泛地用于重組DNA蛋白的穩(wěn)定表達(dá)生產(chǎn)。HEK293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系，它易于轉(zhuǎn)染，是一個(gè)很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。利用瞬時(shí)基因表達(dá)方法，采用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可以快速、方便地獲得mg級(jí)蛋白。

目前還有一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞株正在進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的研發(fā)中，如來源于MadIin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細(xì)胞株（MDCK）、紅系細(xì)胞株、以及人的胚胎干細(xì)胞等。由于不同重組細(xì)胞系表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和糖基化類型不同，需要根據(jù)目的蛋白選擇最佳的重組細(xì)胞系。

從上述研究成果來看，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物在重組細(xì)胞系中取得了積極進(jìn)展，其產(chǎn)生的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的分類越來越清晰，主要分為CHO和HEK293兩大類細(xì)胞。二.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在培養(yǎng)生產(chǎn)中種類得到了拓展，對(duì)推動(dòng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系研究具有重要作用，滿足了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系研究需要。

3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物在重組表達(dá)載體中取得的進(jìn)展

外源基因可以通過病毒載體感染或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染等方式進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒載體是通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等，近幾年桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)也越加受到重視。

質(zhì)粒載體與病毒載體不同，它是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。人工構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體一般為穿梭載體。含有原核基因序列，便于載體在原核細(xì)胞中擴(kuò)增和大量制備，另外含有能使外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及終止子和加polyA信號(hào)序列等。Invitrogen公司的pcDNA系列載體是實(shí)驗(yàn)中常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。

外源基因能否在宿主細(xì)胞中獲得高效表達(dá)主要取決于表達(dá)載體上啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的強(qiáng)弱、二者之間的搭配、以及它們與宿主細(xì)胞類型的兼容性。目前常用表達(dá)載體的啟動(dòng)子包括人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子（CMV-IE）、人延伸因子1-亞基啟動(dòng)子和Rous肉瘤長末端重復(fù)序列。近年來新發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)啟動(dòng)子如人編在蛋白（ubiquitin）C基因啟動(dòng)子以及一些新構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子不僅具有更高的活性，而且具有更廣闊的宿主細(xì)胞范圍。

上述研究表明，不斷地篩選改造載體上的表達(dá)結(jié)構(gòu)元件是優(yōu)化表達(dá)載體、提高蛋白質(zhì)藥物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量的不變的方向。

4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備充足蛋白質(zhì)藥物在生物制備過程中取得的進(jìn)展

哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)過程絕大多數(shù)是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的單細(xì)胞懸浮式培養(yǎng)，反應(yīng)罐的體積可達(dá)20噸。為了節(jié)約成本，減少動(dòng)物血清對(duì)產(chǎn)品的污染，現(xiàn)在主要采用無血清培養(yǎng)基，目前有多家商業(yè)公司提供適用不同細(xì)胞株和不同生產(chǎn)工藝的無血清培養(yǎng)基，如UltraCulture，ProCHO，Pro293等。

考慮到制藥過程的現(xiàn)實(shí)需要，提高生物制備能力是保證蛋白質(zhì)藥物制備取得實(shí)效的關(guān)鍵。從目前的研究過程來看，提高生物制備能力的研究成果主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

4.1 培養(yǎng)方式可以為單細(xì)胞懸浮式培養(yǎng)。這樣可以減少培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)效果，降低培養(yǎng)過程成本。

4.2 反應(yīng)罐的體積可以達(dá)到20噸以上。現(xiàn)有的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將反應(yīng)罐的體積設(shè)定在20噸，并取得了良好的培養(yǎng)效果。因此在蛋白質(zhì)制備過程中，可以根據(jù)實(shí)際需要擴(kuò)大反應(yīng)罐的體積，滿足蛋白質(zhì)制備需要。

4.3 培養(yǎng)中使用無血清培養(yǎng)基。既降低培養(yǎng)基成本，又減少了血清中動(dòng)物成分的污染可能。

5 結(jié)束語

通過本文的分析可知，結(jié)合生物制藥的研究與發(fā)展形勢，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)成為了可能，從目前的研究來看，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物取得了積極進(jìn)展，在重組細(xì)胞系、重組表達(dá)載體和生物制備過程中都取得了進(jìn)展和突破。為此，我們應(yīng)積極推動(dòng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備充足蛋白質(zhì)藥物的研究，為生物制藥發(fā)展提供有力支持。

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