夏循禮

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌 330004)

糖類(lèi)是生物體的主要能源物質(zhì)，葡萄糖有氧氧化過(guò)程是其供能的主要方式。當(dāng)前主要的《生物化學(xué)》教材[1-4]對(duì)該過(guò)程基本描述為：在生物體內(nèi)，葡萄糖(C6H12O6)經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，其H原子經(jīng)過(guò)呼吸鏈傳遞，最終與O反應(yīng)生成H2O，同時(shí)伴隨著氧化還原電勢(shì)轉(zhuǎn)化為自由能，并以化學(xué)能形式儲(chǔ)存在ATP(ADP磷酸化生成ATP)中，生成30～32ATP(或者36～38ATP)；其C原子以有機(jī)酸脫羧的形式生成CO2釋放出來(lái)；其中1分子葡萄糖有氧氧化共產(chǎn)生12對(duì)H原子，氧化磷酸化生成12分子H2O，有機(jī)酸脫酸生成6分子CO2。

綜觀(guān)這些教材的葡萄糖有氧氧化過(guò)程，有兩個(gè)主要問(wèn)題并沒(méi)有闡釋清楚：一是經(jīng)過(guò)呼吸鏈傳遞并與ATP生成量直接相關(guān)的12對(duì)(24個(gè))H原子的來(lái)源問(wèn)題，因?yàn)?分子葡萄糖只有6對(duì)(12個(gè))H原子；二是有機(jī)酸脫羧生成6個(gè)CO2的O原子的來(lái)源問(wèn)題，因?yàn)槠咸烟欠肿又挥?個(gè)O原子，而6個(gè)CO2共需要12個(gè)O原子，以及其它來(lái)源O原子形成有機(jī)酸羧基的機(jī)制如何。檢索近年來(lái)的生物學(xué)科期刊發(fā)表的關(guān)于生物氧化和三羧酸循環(huán)教學(xué)研究的論文[5-8]，對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題或者語(yǔ)焉不詳，或者涉及不深，沒(méi)有能夠全面地解析這兩個(gè)問(wèn)題。鑒于此，筆者在《基于H原子和O原子代謝的葡萄糖有氧氧化解析》[9]一文中已經(jīng)嘗試對(duì)第一個(gè)問(wèn)題作答；本文試就第二個(gè)問(wèn)題概要闡釋。

1 葡萄糖有氧氧化的有機(jī)酸脫羧過(guò)程

葡萄糖有氧氧化過(guò)程中共有3次有機(jī)酸脫羧反應(yīng)，發(fā)生在糖酵解途徑之后，分別為丙酮酸氧化脫羧、異檸檬酸氧化脫羧和α-酮戊二酸氧化脫羧。

1)葡萄糖酵解途徑總反應(yīng)：

2)丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)：

3)異檸檬酸氧化脫羧反應(yīng)：

4)α-酮戊二酸氧化脫羧反應(yīng)：

從上述反應(yīng)可以看出，1分子葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑，分解為2分子丙酮酸和2分子(NADH+H+)：通過(guò)丙酮酸氧化脫羧、異檸檬酸氧化脫羧和α-酮戊二酸氧化脫羧分別各生成1分子CO2，因此1分子葡萄糖共生成6分子CO2，具體為：丙酮酸氧化脫羧生成C0O2的C原子來(lái)源于葡萄糖，O原子來(lái)源于葡萄糖；異檸檬酸氧化脫羧生成CcO2的C原子來(lái)源于(與乙酰輔酶A 和H2O生成檸檬酸的)草酰乙酸，O原子同樣來(lái)源于(與乙酰輔酶A 和H2O生成檸檬酸的)草酰乙酸；α-酮戊二酸氧化脫羧生成CfO2的C原子來(lái)源于(與乙酰輔酶A 和H2O生成檸檬酸的)草酰乙酸，O原子同樣來(lái)源于(與乙酰輔酶A 和H2O生成檸檬酸的)草酰乙酸。

其中丙酮酸氧化脫羧發(fā)生在丙酮酸的C0位羧基上(CbH3-CaO-C0OOH)，異檸檬酸氧化脫羧發(fā)生在異檸檬酸的Cc位羧基上(CfOOH-CeHOH-CdHCcOOH-CbH2-CaOOH)，α-酮戊二酸氧化脫羧發(fā)生在α-酮戊二酸的Cf位羧基上(CfOOH-CeO-CdH2-CbH2-CaOOH)。丙酮酸的C0位羧基來(lái)源于葡萄糖分子，異檸檬酸的Cc位羧基和α-酮戊二酸的Cf位羧基都來(lái)源于三羧酸循環(huán)起始反應(yīng)加入的草酰乙酸(C1(c)OOH-C2(d)O-C3(e)H2-C4(f)OOH)的2個(gè)羧基，分別為其Cc位羧基和Cf位羧基(-C1(c)OOH和-C4(f)OOH)。

葡萄糖氧化脫羧過(guò)程需要解讀的是：與乙酰輔酶A 和H2O反應(yīng)生成檸檬酸(CaOOH-CbH2-CdOHCcOOH-CeH2-CfOOH)的草酰乙酸的2個(gè)羧基(-CcOOH和-CfOOH)分別通過(guò)異檸檬酸氧化脫羧和α-酮戊二酸氧化脫羧形式生成CO2釋放，而三羧酸循環(huán)結(jié)束時(shí)草酰乙酸得到還原；該“還原”的草酰乙酸(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)的C原子來(lái)源及其羧基形成機(jī)制，即可解析外源O原子的來(lái)源問(wèn)題。

2 葡萄糖有氧氧化中加H2O形成羧基(-COOH)

上述三羧酸循環(huán)“還原”的草酰乙酸(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)的4個(gè)C原子來(lái)源分別為乙酰輔酶A (CbH3-CaO-SCoA)的2個(gè)C原子，以及(與乙酰輔酶A 和H2O生成檸檬酸的)草酰乙酸脫羧后“余下”的Cd和Ce位的2個(gè)C原子(C1(c)OOH-C2(d)O-C3(e)H2-C4(f)OOH)；其羧基的形成機(jī)制與3次加H2O反應(yīng)緊密相關(guān)：

5)檸檬酸生成過(guò)程中的加H2O形成羧基

該過(guò)程中H2O分子的-OH加在Ca位形成羧基(-CaOOH)，H加在Cd位形成-OH。

6)琥珀酰輔酶A生成琥珀酸過(guò)程中的加H2O形成羧基

該過(guò)程中H2O分子來(lái)源于：H3PO4+GDP → GTP+H2O，其-OH加在Ce位形成羧基(-CeOOH)。

7)延胡索酸生成蘋(píng)果酸過(guò)程中的加H2O形成羥基，在生成草酰乙酸時(shí)再形成?；?/p>

CaOOH-CbH=CdH-CeOOH(延胡索酸)+H2O → CaOOH-CbHOH-CdH2-CeOOH(蘋(píng)果酸)

該過(guò)程中H2O分子的-OH加在Cb位形成羥基(-CbHOH)，再氧化脫氫形成?；?-Cb=O)。

從上述反應(yīng)(5)、(6)和(7)可以看出，葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑和丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A，加H2O和草酰乙酸生成檸檬酸，H2O以-OH形式加到乙酰輔酶A的?；?Ca=O的C原子上形成羧基-CaOOH；H3PO4和GDP生成GTP和H2O，H2O以-OH形式加到琥珀酰輔酶A的?；?Ce=O的C原子上形成羧基-CeOOH；延胡索酸加H2O生成蘋(píng)果酸，H2O以-OH形式加到延胡索酸的不飽和烯?；?Cb=Cd-的C原子上形成羥基(-CbHOH)，然后氧化脫氫生成草酰乙酸的酰基(-Cb=O)，該草酰乙酸的?；?-Cb=O)再進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成檸檬酸時(shí)即加H2O中的H形成-CdOH-(-CdOH-CcOOH-)，在檸檬酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸后形成-CeOH-(-OHCeH-HCdCcOOH-)，在異檸檬酸氧化脫羧過(guò)程中形成α-酮戊二酸的-Ce=O-CfOOH，在α-酮戊二酸氧化脫羧過(guò)程中形成琥珀酰輔酶A的-Ce=O-SCoA，最終加H2O轉(zhuǎn)化為琥珀酸的羧基-CeOOH(CaOOH-CbH2-CdH2-CeOOH)。

以上3次加H2O反應(yīng)，共加入6個(gè)O原子(2×3H2O=6H2O)到葡萄糖有氧氧化過(guò)程中，2個(gè)O原子參與形成乙酰輔酶A的?；?C=O的C原子來(lái)源的羧基-COOH，此羧基即檸檬酸循環(huán)“還原”的草酰乙酸的Ca位羧基(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)；2個(gè)O原子參與形成2分子琥珀酰輔酶A的?；?Ce=O的C原子來(lái)源的羧基-CeOOH(CaOOH-CbH2-CdH2-CeOOH)，即琥珀酸的羧基-CeOOH，此羧基即三羧酸循環(huán)“還原”的草酰乙酸的Ce位羧基(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)；2個(gè)O原子參與形成三羧酸循環(huán)“還原”的草酰乙酸的?；?C=O，而檸檬酸循環(huán)起始加入的草酰乙酸的酰基-C=O的O原子通過(guò)一系列酶促反應(yīng)進(jìn)入琥珀酰輔酶A的?；?C=O，即三羧酸循環(huán)“還原”的草酰乙酸的Ce位羧基(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)中的另一個(gè)O原子。

綜上所析，葡萄糖有氧氧化過(guò)程中3次有機(jī)酸脫羧：丙酮酸氧化脫羧生成CO2的C原子和O原子都來(lái)源于葡萄糖；異檸檬酸氧化脫羧生成CO2的C原子和O原子都來(lái)源于草酰乙酸的C1(c)位羧基；α-酮戊二酸氧化脫羧生成CO2的C原子和O原子都來(lái)源于草酰乙酸的C4(f)位羧基。檸檬酸循環(huán)最終“還原”的草酰乙酸(C1(a)OOH-C2(b)O-C3(d)H2-C4(e)OOH)的C1(a)和C2(b)位C原子來(lái)源于丙酮酸氧化脫羧生成的乙酰輔酶A，C3(d)和C4(e)位C原子來(lái)源于三羧酸循環(huán)起始草酰乙酸的C2(d)和C3(e)位C原子，其C1(a)位羧基的2個(gè)O原子分別來(lái)源于葡萄糖和H2O；C2(b)位?；?C=O的O原子來(lái)源于H2O；C4(e)位羧基的2個(gè)O原子分別來(lái)源于H2O和三羧酸循環(huán)起始反應(yīng)加入草酰乙酸的?；?C=O的O原子。

所以，葡萄糖有氧氧化過(guò)程中CO2生成的有機(jī)酸脫羧機(jī)制為：葡萄糖通過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成丙酮酸，丙酮酸氧化脫羧生成CO2；異檸檬酸氧化脫羧生成CO2，“借用”的草酰乙酸的C1(c)位有機(jī)酸羧基通過(guò)乙酰輔酶A的酰基-C=O加H2O生成羧基“歸還”；α-酮戊二酸氧化脫羧生成CO2，“借用”的草酰乙酸的C4(f)位有機(jī)酸羧基通過(guò)琥珀酰輔酶A的?；?C=O加H2O生成羧基“歸還”。葡萄糖有氧氧化過(guò)程中加H2O成為有機(jī)酸脫羧反應(yīng)的羧基來(lái)源的關(guān)鍵。

關(guān)于葡萄糖有氧氧化通過(guò)有機(jī)酸脫羧生成CO2的機(jī)制，朱欽士[10]、吳劍侯認(rèn)為[11]：葡萄糖的C原子不能直接與O2中的O原子結(jié)合。為了解決這個(gè)難題，線(xiàn)粒體采用了一個(gè)非常聰明的“以H換C”的迂回方式，先在“燃料”分子中的C原子上加上H2O(在C=C雙鍵處)。H2O是由一個(gè)O原子和兩個(gè)H原子組成的(H2O, 即H-O-H)。在被加到食物分子中的C原子上以后，原來(lái)H2O上的H被脫掉(由脫氫酶催化)，留下O原子與食物分子中的C原子結(jié)合。然后C原子再帶著兩個(gè)O原子從食物分子中被分離出來(lái)(由脫羧酶催化)，成為CO2。機(jī)體呼出的CO2就是這樣形成的(所以機(jī)體呼出的二氧化碳里面的O，并不來(lái)自機(jī)體吸進(jìn)的O，而是來(lái)自H2O)。這樣，C原子作為“燃料”的價(jià)值，就被“轉(zhuǎn)移”到了H原子上。同樣，這些H “燃料”也是來(lái)自H2O分子。

從本文的解析來(lái)看，線(xiàn)粒體“以H換C”的方式成立，即以H2O的H原子，換取葡萄糖的C原子，H原子被脫氫酶脫下來(lái)，由輔助因子(NAD+和FAD)傳遞到呼吸鏈，伴隨氧化磷酸化過(guò)程合成ATP，C原子結(jié)合H2O的O原子形成有機(jī)酸羧基，以氧化脫羧方式生成CO2釋放出來(lái)，結(jié)果是葡萄糖的C原子作為“燃料”的價(jià)值，被“轉(zhuǎn)移”到了加入的H2O的H原子上。但是，“以H換C”的方式不是在C=C雙鍵處加上H2O，而是在各中間產(chǎn)物(如乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A)的酰基-C=O上加上H2O的-OH，形成羧基-COOH，最終以有機(jī)酸脫羧生成CO2。

3 有機(jī)酸脫羧與氧化磷酸化合成ATP

1個(gè)葡萄糖分子徹底氧化生成CO2和H2O，共產(chǎn)生6個(gè)CO2和12對(duì)脫氫酶輔助因子結(jié)合的H原子(以NADH+H+和FADH2形式存在)：細(xì)胞液中糖酵解途徑產(chǎn)生2對(duì)H原子(NADH+H+形式)，線(xiàn)粒體中產(chǎn)生10對(duì)H原子(8對(duì)NADH+H+形式，2對(duì)FADH2形式)。

1個(gè)葡萄糖分子共有6對(duì)H原子(12個(gè))，全部轉(zhuǎn)化為脫氫酶輔助因子結(jié)合的H原子，另外的6對(duì)H原子(12個(gè))則來(lái)源于上述加H2O反應(yīng)過(guò)程中加入的6個(gè)H2O。來(lái)源于6個(gè)H2O的6對(duì)H原子由相應(yīng)的脫氫酶從底物分子上脫下，通過(guò)呼吸鏈-氧化磷酸化與機(jī)體吸進(jìn)的O反應(yīng)生成H2O，釋放的自由能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能儲(chǔ)存在ATP中。

葡萄糖有氧氧化過(guò)程中加入的6分子H2O提供的6對(duì)H原子產(chǎn)生了多少ATP呢？

有機(jī)酸脫羧生成CO2發(fā)生在丙酮酸氧化脫羧和三羧酸循環(huán)兩個(gè)階段，3次加H2O反應(yīng)都發(fā)生在三羧酸循環(huán)，在這兩個(gè)階段共發(fā)生5次脫氫酶催化的反應(yīng)，產(chǎn)生2×4(NADH+H+)，2×1FADH2，只要確認(rèn)產(chǎn)生的FADH2的H原子是否來(lái)自加入的H2O，就可以計(jì)算出加入的H2O“以H換C”產(chǎn)生了多少ATP。

FADH2的2個(gè)H原子分別來(lái)源于琥珀酸(CaOOH-CbH2-CdH2-CeOOH)的Cb位和Cd位上的H原子,其中Cb位的H原子來(lái)源于乙酰輔酶A的甲基-CH3上的H原子，源頭上其來(lái)自于葡萄糖的H原子；Cd位的H原子來(lái)源于草酰乙酸的非羧基C原子(C3(e)位)上的H原子，所以，F(xiàn)ADH2的2個(gè)H原子不是來(lái)源于加H2O“以H換C”的H2O中的H原子。

加H2O“以H換C”的6個(gè)H2O中的12個(gè)H原子全部以6個(gè)NADH+H+形式傳遞到呼吸鏈，通過(guò)氧化磷酸化與O反應(yīng)生成H2O，釋放的自由能中一部分轉(zhuǎn)化為化學(xué)能儲(chǔ)存在15ATP中：

1分子NADH+H+經(jīng)過(guò)呼吸鏈-氧化磷酸化產(chǎn)生2.5分子ATP；

6分子NADH+H+經(jīng)過(guò)呼吸鏈-氧化磷酸化產(chǎn)生6×2.5分子ATP=15ATP。

4 總結(jié)

綜合以上分別針對(duì)葡萄糖有氧氧化的有機(jī)酸脫羧過(guò)程、加H2O“以H換C”形成有機(jī)酸羧基機(jī)制、以及加H2O“以H換C”與氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 3個(gè)部分的解析，我們可以得出如下結(jié)論：

1)葡萄糖有氧氧化過(guò)程產(chǎn)生12對(duì)以NADH+H+和FADH2形式存在的H原子，其中6對(duì)H原子來(lái)源于“以H換C”的加H2O反應(yīng)，由脫氫酶脫下以NADH+H+形式傳遞到呼吸鏈，與O反應(yīng)生成H2O，同時(shí)釋放能量生成15個(gè)ATP。加H2O反應(yīng)的H2O有兩種來(lái)源：一是直接加入基質(zhì)中的H2O；二是H3PO4和GDP反應(yīng)生成GTP時(shí)產(chǎn)生的H2O。

2)葡萄糖有氧氧化的C原子通過(guò)有機(jī)酸脫羧方式生成CO2釋放出來(lái)，葡萄糖分子的6個(gè)C原子以有機(jī)酸脫羧方式生成CO2需要12個(gè)O原子，葡萄糖提供6個(gè)O原子，另外6個(gè)O原子由“以H換C”加入的6個(gè)H2O提供。H2O的-OH加到中間產(chǎn)物的?；?C=O上形成羧基-COOH，再以有機(jī)酸脫羧生成CO2完成葡萄糖C原子的徹底代謝。

3)葡萄糖有氧氧化的有機(jī)酸脫羧有兩種方式：一是葡萄糖經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)行有機(jī)酸脫羧生成CO2；二是丙酮酸通過(guò)乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)，“借用”草酰乙酸(生成檸檬酸)執(zhí)行有機(jī)酸脫羧，完成葡萄糖全部C原子生成CO2的代謝，而“借用”的草酰乙酸在一系列脫氫和加H2O的酶促反應(yīng)后得到“歸還”。

4)葡萄糖有氧氧化過(guò)程中的有些加H2O反應(yīng)，并不參與“以H換C” 形成有機(jī)酸羧基機(jī)制，如檸檬酸經(jīng)過(guò)順烏頭酸生成異檸檬酸的加H2O和脫H2O反應(yīng)，這種性質(zhì)的加H2O和脫H2O反應(yīng)只是為了底物分子的-OH和H的位置置換、分子內(nèi)部重組而進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)；有些反應(yīng)發(fā)生的脫H2O反應(yīng)，如2-磷酸甘油酸脫H2O生成磷酸烯醇式丙酮酸，并不減少葡萄糖分子的O原子和H原子數(shù)量，它們只是把葡萄糖代謝途徑“暫時(shí)”引入的O原子和H原子“清除”掉。這些加H2O和脫H2O反應(yīng)當(dāng)然也不會(huì)影響到葡萄糖徹底氧化通過(guò)呼吸鏈-氧化磷酸化生成ATP的數(shù)量。

5)三羧酸循環(huán)途徑通過(guò)“借用”草酰乙酸還有一個(gè)重要生理作用。食物來(lái)源的葡萄糖經(jīng)過(guò)有氧氧化途徑徹底氧化，其6個(gè)C原子只有2個(gè)以CO2形式釋放出來(lái)(丙酮酸氧化脫羧反應(yīng))，另外4個(gè)C原子則進(jìn)入三羧酸循環(huán)(以2個(gè)乙酰輔酶A形式)參與合成2個(gè)檸檬酸分子，最終交換至三羧酸循環(huán)結(jié)束時(shí)“歸還”的2個(gè)草酰乙酸分子上；而三羧酸循環(huán)起點(diǎn)的(參與合成2個(gè)檸檬酸分子的)機(jī)體內(nèi)的2個(gè)草酰乙酸分子上的羧基以有機(jī)酸脫羧方式生成4個(gè)CO2釋放出來(lái)，表觀(guān)上體現(xiàn)為葡萄糖分子的6個(gè)C原子全部轉(zhuǎn)化為CO2。事實(shí)上，通過(guò)三羧酸循環(huán)途徑，食物來(lái)源的葡萄糖(以乙酰輔酶A形式)與機(jī)體內(nèi)的草酰乙酸進(jìn)行了C原子的交換：葡萄糖的C原子有三分之一(2/6)通過(guò)丙酮酸氧化脫羧以CO2形式釋放出來(lái)，三分之二(4/6)通過(guò)三羧酸循環(huán)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的草酰乙酸；同時(shí)，機(jī)體內(nèi)的2個(gè)草酰乙酸分子通過(guò)三羧酸循環(huán)對(duì)其C原子進(jìn)行了二分之一(4/8)的更新。該過(guò)程(或生理功能)可以通過(guò)三羧酸循環(huán)連續(xù)不斷地進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)外生物分子中C原子的“更新”。認(rèn)識(shí)到三羧酸循環(huán)是葡萄糖、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的共同途徑，則對(duì)這種機(jī)體內(nèi)外生物分子中C原子“更新”機(jī)制的意義應(yīng)引起更大的重視。

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