王 芳，楊 帆

(1. 中國科學技術大學 科技考古實驗室, 合肥 230026; 2. 云南省文物考古研究所, 昆明 650000)

2008年Caroline Solazzo等人在Anal. Chem.雜志發(fā)表論文，報告了一項有關考古出土的蛋白質殘留樣品分析工作。他們從阿拉斯加最北端，臨近北冰洋著名的巴羅角(Point Barrow)出土約700到900年前的陶器碎片上的粘土狀附著物中成功提取古蛋白，并對其進行質譜分析測定，得到該蛋白來源于灰海獅的明確結果。這是第一次成功地運用生物質譜技術和蛋白組學方法在較古老的考古樣品中提取到殘留蛋白，并通過序列分析明確鑒定出其蛋白質來源的一項出色研究[1]。該項成果對于了解古代巴羅角居民的食物結構和來源提供了重要科學依據(jù)。

考古樣品中蛋白質成分能否完好保存到今天，取決于環(huán)境和時間兩個因素，環(huán)境越潮濕溫熱，微生物的活躍程度就越高，對蛋白質肽段的修飾越大；而樣品的年代越久遠，蛋白質的降解程度也越強。巴羅角地區(qū)的極寒天氣對于微生物環(huán)境條件的抑制作用使得對該樣品研究的成功可能性大為增加；同時，年代愈是久遠的考古樣品，發(fā)生降解或者修飾等變化的可能性越大。

對于中國考古學實際而言，中國的地理位置大部分處于溫帶大陸性氣候，這使得與前面所介紹的研究相比，微生物的活動更為頻繁，對蛋白質分子的修飾和降解作用也更加劇烈，又由于中國出土的考古樣品很多都有更長的歷史時間背景，時間上遠遠久于上述文章中的樣品。所以，針對中國的情況，在環(huán)境和時間上對蛋白質分子的保存狀態(tài)更為不利。

在本研究中，我們以2010年3月云南個舊黑馬井遺址出土青銅容器內兩份不同保存狀態(tài)的樣品為研究對象，擬應用生物質譜技術并結合蛋白質組學分析方法，對古代食物殘留物樣品進行研究。

個舊黑瑪井遺址是一處十分重要的考古遺址[2]，通過對其出土材料研究顯示該遺址的年代約為西漢末期。我們想通過本次研究來探索更早的加工過的食物殘留樣品有沒有保存留有蛋白信息，蛋白組學的研究方法能否對更古老的樣品發(fā)揮作用。并且該樣品的形態(tài)也與Caroline Solazzo等人研究的樣品形態(tài)不盡相同，他們的樣品是陶器碎片上附著的粘土狀食物殘留，本研究的樣品是青銅器內完整的塊狀膏狀物以及顆粒狀物，我們也期待探討考古殘留物樣品的形態(tài)對蛋白組學方法的適用性。除了樣品的年代和狀態(tài)的不同, 樣品的保存條件也不同, Caroline等人的樣品來自極寒的阿拉斯加地區(qū), 這無疑更有利于樣品中蛋白質的保存, 而本次實驗的樣品只是來源于普通環(huán)境條件下的地下埋藏。所以, 本實驗擬通過此次研究獲得蛋白質組學方法對考古樣品研究的進一步探索和完善。我們使用的方法是首先從古代殘留物中用生物化學方法將蛋白質提取出來，并利用胰蛋白酶進行限制性降解，再通過質譜的方法獲得一系列蛋白質肽段，最后通過和已有的各種不同物種的蛋白質數(shù)據(jù)庫進行序列對比，推斷出這些蛋白質是來自哪個物種。該方法具有靈敏度極高，以及重復性好的特點，但同時也對樣品的要求較高，即樣品中所含的蛋白質不能被完全降解[3]。

1 樣品分析

1.1 樣品描述

本次實驗的材料來自于由云南省考古研究所2010年3月15日對個舊黑馬井墓地進行第3次正式發(fā)掘所獲得的2個樣品。樣品一為一個青銅三羊盒(M29)中的膏狀疑似食物殘渣(圖1)，以下簡稱膏狀樣品；樣品二為銅簋(M43:4)內采集的顆粒狀疑似食物殘渣(圖2)，以下簡稱顆粒狀樣品。本次所檢測的兩個樣品根據(jù)其所存放的位置及其形態(tài)來判斷極有可能是食物殘渣，結合國際上已研究成功的案例，我們同樣采取提取蛋白質并利用質譜分析的方法來鑒定是何種材料制作成的食物殘留。運用相同的蛋白質組學方法對兩種保存狀態(tài)不同的樣品進行研究的主要目的是為了獲得對比數(shù)據(jù)，以期更好地證明運用蛋白質組學方法進行考古殘留物分析的可行性。

圖1 樣品一的正面照(左)和背面照(右)

圖2 樣品二的照片

1.2 實驗試劑、儀器和實驗方法

1.2.1 實驗試劑、儀器

實驗儀器:液相色譜-質譜聯(lián)用儀(廠家：Thermo Fisher, 美國，型號：LTQ), 微量天平(廠家：梅特勒-托利多，中國，型號：XP21)，細胞超聲破碎儀(廠家：寧波新芝，中國，型號：JY99-IIDN)，電泳裝置(廠家：Bio-Rad，美國, 型號：mini-protean system)，冷凍高速離心機 (廠家：Epeendorf，美國，型號：5430R)，以及pH計(廠家：梅特勒-托利多，中國，型號：FE20)。實驗試劑見表1。

表1 實驗試劑

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 預處理樣品、提取蛋白并優(yōu)化

稱取250 mg殘留物樣品, 并用液氮快速將樣品研磨成粉末狀，然后將粉末狀樣品放置入1.5 mL的Eppendorf管中。在樣品中加入500 μL細胞裂解液，并放置于冰上30 min，然后對樣品進行超聲處理，以促進樣品中蛋白質的溶解。最后，以13200 r/min，4 ℃離心20 min，以去除樣品溶液中的不溶物。上步離心后發(fā)現(xiàn)仍有很多不溶物懸浮在溶液中，用200目的濾網過濾樣品中的不溶物；再次以13200 r/min, 4 ℃離心20 min。并保留上清液；將提取獲得的上清液中加入5倍于上清液體積的蛋白質沉淀溶液, 并將其置于-20 ℃，冷凍過夜；將處理后的樣品13200 r/min, 4 ℃離心20 min，并取沉淀(如果樣品中含有蛋白質，將處于此沉淀中)；用蛋白質沉淀溶液洗滌蛋白質沉淀2次；將處理過的樣品于室溫下敞口放置，直至其中所含的有機溶劑完全揮發(fā)；加入20 μL PBS緩沖液溶解蛋白沉淀；最后，加入5 μL 5×蛋白加樣液，并在95 ℃下處理5 min。

1.2.2.2 蛋白質分離及染色

用12% SDS-PAGE分離上述樣品中的蛋白質；在室溫下用考馬斯亮藍染色液對蛋白膠進行染色2 h；最后在室溫下用考馬斯亮藍脫色液對染色的蛋白膠脫色，直至獲得凝膠上藍色的條帶及干凈的背景[4]。

1.2.2.3 質譜分析前樣品的預處理

將上述染色后的蛋白質條帶進行切割至1 mm3大小，用50 mM NH4HCO3溶液洗2次；用100 μL新鮮配制的10 mM DTT/50 mM NH4HCO3溶液處理膠塊(50 ℃，15 min)；用100 μL新鮮配制的30 mM碘代乙酰胺/50 mM NH4HCO3溶液處理膠塊(室溫，避光15 min)；用50 mM NH4HCO3溶液洗滌膠塊2次；用200 μL30%已腈/50 mM NH4HCO3溶液處理膠塊(室溫，10 min)，并重復這一步驟直至染色的膠塊得以全部脫色；分別用200 μL 50%已腈/50 mM NH4HCO3溶液和100%已腈溶液洗滌膠塊，并移除液體；用真空干燥儀對膠塊進行干燥，并加入50 μL的胰蛋白酶溶液進行消化(37℃，過夜消化)，保留此步的上清液；對上一步胰酶處理后的膠塊進一步用200 μL 60%已腈/5%三氟乙酸溶液處理，并進行水浴超聲1 min，吸取此步的上清液，并和前一步得到的上清液合并；用真空干燥儀對合并后的溶液進行干燥；最后用25 μL 0.1% 甲酸溶液溶解干燥后的沉淀，以進行液相色譜-質譜分析。

表2 液相色譜分離條件

1.2.2.4 液相色譜分離條件

我們所使用的液相色譜的型號為SURVEYOR；色譜柱種類為C18反相柱；梯度時間為175 min；梯度條件如下(A為0.1%甲酸水溶液，B為100%已腈)。分流后NSI流速為800～1000nL/min。

1.2.2.5 質譜分析條件

質譜分析的檢測模式為正離子模式；掃描范圍為300～2000 m/z；碰撞能量為35.0。

1.2.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

質譜分析得到的數(shù)據(jù)通過Bioworks軟件(SEQUEST 3.2)進行分析，搜索的NCBI數(shù)據(jù)庫包括不同的種屬來源，如人源(Homo Sampiens)、雞源(Gallus gallus)、野豬源(Sus scrofa)以及綿羊源(Ovis aries)。

2 結果及分析

2．1 膏狀樣品的實驗結果及分析

蛋白提取結果：通過上述提取的蛋白質樣品，經過SDS凝膠電泳分離，以及考馬斯亮藍染色后，獲得的圖片如下(圖3)。

圖3 樣品一提取的蛋白質電泳后的圖片

左邊的一豎排泳道內是標準分子量蛋白，分子條帶從下往上依次分子量為：15kD、25kD、35kD、45kD、66kD、116kD，而參照標準分子量蛋白可以看到：一條帶在約47kD左右的位置，一條帶在約116kD的位置。

質譜檢測結果：將所檢測到的蛋白條帶從蛋白膠上切割下來并進行質譜分析之后，發(fā)現(xiàn)蛋白質被胰蛋白酶限制性降解形成比較好的蛋白質肽段峰圖(圖4)，橫坐標顯示的是蛋白質肽段在色譜柱中上樣后的洗脫時間，縱坐標顯示的是質譜檢測器檢測的相對離子信號強度，此數(shù)值越大，表明含有的蛋白質肽段的豐度越高。通常認為洗脫時間為0～40 min內得到的樣品峰圖中包含了非特異性峰，另外，洗脫時間為140 min之后所得到的樣品峰圖也存在一些非特異性峰，因此，為了排除非特異性峰的影響，通常通過洗脫時間在40～140 min之間得到的樣品峰作為樣品質量好壞的重要指標[5]。從得到的蛋白質肽段峰圖來看, 不論是從縱坐標的離子信號強度，還是橫坐標的蛋白質肽段分布的連續(xù)性，都進一步驗證了考馬斯亮藍染色結果：即此膏狀食物殘渣中確實含有大量的蛋白質。另外，我們需要指出的是，從此圖也可以看出殘留物中含有的蛋白質并沒有被完全酶解，這有可能是因為古代殘留物的保存時間很長，蛋白形成了聚集或發(fā)生了修飾，最終導致樣品沒有辦法被完全胰蛋白酶降解。

圖4 提取的蛋白質經過胰蛋白酶降解后經過質譜分析的

蛋白名稱質譜檢測出的蛋白質肽段Z值XcorrDeltaCNkeratin 1keratin 10keratin 2akeratin 6CH2A histone family proteinK.SKAEAESLYQSK.YR.TLLEGEESR.MR.NKYEDEINKR.TR.FLEQQNQVLQTK.WK.YEELQITAGR.HK.IEISELNR.VR.TNAENEFVTIK.KK.SLNNQFASFIDK.VR.SLDLDSIIAEVK.AR.THNLEPYFESFINNLR.RR.SLLEGEGSSGGGGR.GR.ALEESNYELEGK.IR.SQYEQLAEQNRK.DR.LKYENEVALR.QR.LASYLDKVR.AR.VLDELTLTK.AK.IRLENEIQTYR.SK.GSLGGGFSSGGFSGGSFSR.GR.NVQALEIELQSQLALK.QK.TIDDLKNQILNLTTDNANILLQIDNAR.LR.FLEQQNQVLQTK.WK.IEISELNR.VR.TAAENDFVTLKK.DK.VDLLNQEIEFLK.VR.NLDLDSIIAEVK.AR.NKYEDEINKR.TR.FLEQQNKVLETK.WR.NLDLDSIIAEVK.AR.AGLQFPVGR.VR.VTIAQGGVLPNIQAVLLPK.K2222222222222222222322222222224.012.782.744.133.652.622.893.884.272.843.334.193.923.242.512.943.525.053.684.794.132.622.783.624.362.743.674.362.793.490.520.200.370.110.270.200.340.40.410.440.470.580.510.280.120.460.410.650.550.500.110.200.310.530.470.370.110.470.390.4

以上經過質譜分析所檢測到的蛋白質肽段進一步和美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)所擁有的所有已有的不同種屬蛋白質庫進行比對(Blast)，僅在人、雞、野豬、以及綿羊的蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索到少量蛋白質，所得到的結果列表如下(表3～表6)。

表4 通過質譜檢測得到的疑似雞源蛋白的肽段以及對應的蛋白名稱

表5 通過質譜檢測得到的野豬源蛋白的肽段以及對應的蛋白名稱

表6 通過質譜檢測得到的疑似綿羊源蛋白的肽段以及對應的蛋白名稱

對于所得到的這一結果，我們進行了進一步的分析，具體如下：

得到的可能的人源蛋白質共有5種，分別為角蛋白家族蛋白Keratin 1、Keratin 10、Keratin 2a、Keratin 6C以及組蛋白家族蛋白H2A。通過質譜獲得的對應每種蛋白質的肽段都至少超過兩個，這說明了我們提取的蛋白質中確實含有這5種蛋白。我們也列出了人源蛋白Keratin 1一種多肽的二級質譜圖和對應的氨基酸序列(圖5)，這也進一步確定了上述結果的準確性。角蛋白和組蛋白雖然在功能上沒有任何相關性，但它們具有一個共同點，即它們在細胞內具有極高的豐度，也就是說，在質譜分析的過程中，這些蛋白是最大的潛在污染源。我們這里檢測到的Keratin和H2A很大的可能是在考古發(fā)掘的過程中引入的污染(如皮膚碎屑)，當然也有可能是在蛋白質提取以及質譜檢測的過程中引入的污染，但這一過程中的污染的可能性是極小的, 重要的是，我們除了Keratin和H2A之外，并沒有檢測到其它正常組織中豐度較高的膠原蛋白降解物或任何特異性的人源蛋白質，這表明我們檢測的該考古樣品并不來源于人源。從這里我們也可以看出，因為污染問題是考古樣品分析中的常見問題，而蛋白組學方法的應用可以很明確的排除一些污染干擾的問題。

圖5 人源Keratin 1蛋白多肽的二級質譜圖和對應的氨基酸序列

通過質譜分析后得到的可能的雞源蛋白質有兩種：DJ1和NT-3 growth factor receptor。其中DJ1在細胞中發(fā)揮了多方面的功能，研究表明，它在雄激素受體依賴的轉錄過程中發(fā)揮了重要的作用，另外，它也作為一個伴侶蛋白在氧化應激過程中發(fā)揮著功能[6]。NT-3 growth factor receptor，顧名思義，它是神經生長因子NT-3的特異性受體，介導了NT-3在細胞中的信號轉導過程。雖然這兩種蛋白不屬于像Keratin和Histone這一類常見的污染源，但是在我們的質譜檢測中，這兩種蛋白分別只檢測到各自一個獨立的肽段，這使得我們不能完全判斷該古代殘留物是否一定含有雞源的蛋白質。

另外，通過質譜檢測獲得的可能的野豬源蛋白質有8種，分別為Kelch domain containing 6、Zinc finger protein 140、Neolin-3 precursor、TATA element modulatory factor 1、SIII p15 subunit、Tyrosine 3-monooxygenase、General transcription factor IIIC 以及Isocitrate dehydrogenase 3。然而，通過質譜分析也只檢測到各種不同蛋白質的一個獨立肽段，因此沒有顯著的生物學意義，換而言之，我們仍然無法判斷該檢測樣品中所含的蛋白質是否一定來自于野豬。

通過質譜檢測得到的可能的綿羊源蛋白質有6種，這包括：Toll-like receptor 5、RNA directed RNA polymerase L、Diacylglycerol acyltransferase 1、14-3-3 protein zeta、POMP90B precursor以及TNF superfamily member 5-induced protein。和上述兩種種屬蛋白質一樣，質譜分析僅能檢測到以上6種不同蛋白質分別對應的一個獨立肽段，因此，也無法完全判斷我們檢測的殘留物中的蛋白質是否一定來源于綿羊。

綜上所述，從樣品一中獲得的蛋白質提取物，通過蛋白質染色以及質譜分析，可以看出確實含有大量的多肽峰，也就是說，我們檢測的樣品中確實含有大量的蛋白質。這表明，當古代殘留物存在于合適的外部條件下，它其中的蛋白質完全有可能得以保存；而且，只要古代殘留物樣品的保存狀態(tài)好，運用蛋白質組學方法對其進行分析就具有高度可行性。然而，當我們將質譜分析得到的多肽與包含全部已有種屬的蛋白質數(shù)據(jù)庫比對時，我們僅得到了少量的蛋白質信息。目前，我們僅僅可以肯定其中含有人源蛋白質，但正如前面分析的，這些人源蛋白質是因為在考古發(fā)掘或者后期的樣品處理時引入的污染。而其它種屬來源的蛋白質雖然也檢測到一些，但是只檢測到了每一種蛋白相對應的一個獨立肽段，這在生物學上無法判斷是否來源于這些物種[7]。為了排除樣品中的蛋白質來源于細菌，我們也將質譜分析結果與蛋白質數(shù)據(jù)庫進行比對，并沒有發(fā)現(xiàn)有細菌蛋白的信息。并且，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對所提蛋白進行的檢測，蛋白主要集中在兩個分子量的條帶上(見圖3)，而如果是細菌蛋白，會呈現(xiàn)出非常雜多的分子量條帶，所以基本排除該蛋白來源于細菌的可能。因此，根據(jù)所得到的此樣品中確實存在大量蛋白質的結果，并綜合考慮樣品的盛放位置，我們認為該樣品極有可能是一份食物殘留物。

至于為什么蛋白質染色和質譜分析證明了樣品一中確實含有大量的蛋白質，但是通過已有的數(shù)據(jù)庫卻無法找出它們相對應的種屬，我們推斷有以下兩種可能性：1)該殘留物中的蛋白質源自的種屬在目前我們的蛋白質數(shù)據(jù)庫并沒有包括進來。2)因為該殘留物存在于三羊盒中，有可能該殘留物曾經經過長時間的高溫燒煮并發(fā)生了美拉德反應，也就是糖的羥基和氨基酸的氨基之間發(fā)生反應，從而使得蛋白質被修飾[8]，而被修飾之后的蛋白質肽段與原始的未修飾的實際肽段相比，其分子量被加大，這種情況下，這個修飾的肽段就無法通過已有的蛋白質數(shù)據(jù)庫比對出來，因此，如果這一類的修飾發(fā)生的比例很高的話，就會使得整個蛋白質無法被鑒定。

除了高溫處理，外界的特殊環(huán)境也有可能導致蛋白質發(fā)生特異性的修飾或者聚集，這些蛋白的修飾或聚集雖然一方面使得它們免受外界微生物或蛋白酶的降解，從而得以較為完整的保存下來，但另一方面也使得通過質譜的方法無法鑒定這些蛋白質的種屬來源。我們的蛋白質純化結果暗示此種可能性比較大，因為我們提取的蛋白質經過分離和染色后主要表現(xiàn)為兩種分子量大小(116kD和47kD)，而其它的分子量的蛋白質都沒有被保存下來，這暗示這兩種分子量的蛋白質發(fā)生了大量的修飾而沒有被降解掉。

2.2 顆粒狀樣品的實驗結果及分析

樣品二經過蛋白質提取、分離及染色后并沒有檢測到任何蛋白條帶。表明銅簋內采集的顆粒狀疑似食物殘渣中現(xiàn)在并不存在殘留的蛋白質，這有兩種可能性：1)這種疑似食物殘渣并不是真正的食物殘渣，其中根本不含有蛋白質；2)如果它們是真正的食物殘渣，那么有可能它們出土時的存在狀態(tài)使得其含有的蛋白質被徹底地降解了，這也進一步暗示古代蛋白質的保存狀態(tài)對于其穩(wěn)定性具有很大的影響(圖略)。

3 討論

近年來，基于質譜技術的蛋白質組學方法已開始運用于考古學的研究，并有一些成功的例子[9-15]。本研究在國內的考古學研究中首次采用從殘留物中直接提取蛋白質的方法，對古代殘留可見疑似食物殘渣成分進行成分分析，并加以鑒定蛋白質種屬, 從而判定食物殘渣的屬性, 結果顯示，樣品一中存在大量的殘留蛋白質，而樣品二中沒有任何殘留蛋白質。這進一步表明，考古樣品的形態(tài)會對其中的蛋白質的保存產生極為重要的影響。我們的假設是，樣品一的蛋白質得以保存是因為殘留物的膏狀物的存在形式，這可能很大程度上使得膏狀物內的蛋白質組分和外界環(huán)境相分離，從而形成了一種天然屏障，因此環(huán)境中的微生物無法和膏狀物內部蛋白接觸并對其進行充分降解，這最終使得其含有的蛋白質被較為完好的保存下來。膏狀樣品中古蛋白的檢出，表明在中國的溫帶環(huán)境地區(qū), 年代久遠的樣品中的蛋白質是完全能夠保存下來的。

4 結語

食物殘留物出土時的狀態(tài)，有的樣品保存完好，甚至與原來的形態(tài)無異，有的則已完全分解塵化，而介于這兩種狀態(tài)之間的出土的樣品，就需要我們采取有效的手段來對其進行鑒定。蛋白質質譜方法對這些中間狀態(tài)樣品的檢測是極為有效的，它可以通過樣品中的蛋白信息來反映原來樣品的結構成分。本實驗采用蛋白質組學分析結合質譜方法，先從古代殘留物中將含有的蛋白質提取出來；再用胰蛋白酶或其它的蛋白酶對提取的蛋白質進行限制性降解，從而形成不同大小的蛋白質肽段；然后通過液/氣質聯(lián)用分離并檢測蛋白質肽段；最后通過和已有的不同物種的蛋白質數(shù)據(jù)庫比對，從而推斷殘留物蛋白質的物種來源。蛋白質組學和質譜技術的聯(lián)用可以幫助我們判斷形態(tài)不明的古樣品的成分及來源。

本論文在國內的科技考古學研究中首次采用從殘留物中直接提取蛋白質的方法，對古代食物殘渣成分進行分析，并鑒定蛋白質種屬, 從而判定食物殘渣的屬性，是國內這一領域首開先河的初步探討。本研究中的膏狀樣品通過蛋白組學的分析，發(fā)現(xiàn)其中含有大量的古蛋白信息，雖然我們送檢的質譜儀不能分析出該蛋白的明確信息，但根據(jù)嚴格的分子生物學實驗，其中的大量蛋白的存在是毋庸置疑的，結合Caroline Solazzo等人發(fā)現(xiàn)的約800年前的陶器碎片中的蛋白，這表明2000年前到800年前的考古樣品中，甚至保存條件更好情況下早于2000年前的樣品，用蛋白組學方法對其中合適的樣品進行實驗分析是極有應用前景的。

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