郭婷婷，婁永江

(寧波大學 海洋學院, 浙江 寧波 315211)

布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii，俗稱油藻)，是一種適應性較強的單細胞綠色微藻，大小在30～500 μm左右[1,2]。布朗葡萄藻富含胞外多糖、維生素和多不飽和脂肪酸等物質，有較強的產(chǎn)烴能力，其產(chǎn)烴量最高可達細胞干重的86%，遠遠高于其它微生物的產(chǎn)烴量(幾乎都低于1%)，在食品生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用較為廣泛，是近年在保健食品生產(chǎn)及魚、蝦育苗等領域應用較佳的經(jīng)濟藻類[3-7]。布朗葡萄藻作為二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等高度不飽和脂肪酸和可再生、無毒的生物質液體燃料的新來源日益受到國內(nèi)外科研工作者的重視[8,9]。目前由于布朗葡萄藻采收困難，導致其生物質采收費用要遠大于其養(yǎng)殖的費用[7,10]，已嚴重阻礙布朗葡萄藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此研究布朗葡萄藻的沉降及采收具有較大的價值。無機絮凝劑絮凝沉降法具有高效、易控制、廉價等優(yōu)點，在微藻的采收上應用廣泛。林喆、黃振英[7,10]等研究表明通過無機絮凝劑可以在保持藻體的活性下使藻類沉淀，從而達到濃縮的效果，便于采收。而關于無機絮凝劑對布朗葡萄藻的絮凝效應的研究未見報道。為此，本文采用單因子試驗方法，研究了不同濃度的硫酸鋁、硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鐵對布朗葡萄藻絮凝效果的影響，旨在確定其絮凝最佳無機絮凝劑及濃度，以期為布朗葡萄藻的采收提供理論依據(jù)和科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用布朗葡萄藻由寧波大學生物餌料培養(yǎng)實驗室提供。用于微藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，采用MAV[11]培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，自然光照，不充氣培養(yǎng)15～30 d。

1.2 方法

1.2.1 布朗葡萄藻測定波長確定

采用光譜掃描法[12, 13]。選取同一批不同細胞密度的藻液，以MAV培養(yǎng)液作為空白對照，在620～700 nm間每隔5 nm進行光譜掃描，繪制吸收曲線，選擇吸光值較高且平穩(wěn)的波長為其測定波長。

1.2.2 布朗葡萄藻細胞密度標準曲線繪制

采用光密度法[12, 13]，以細胞密度表征布朗葡萄藻的生物量。配制不同細胞密度的布朗葡萄藻藻液，采用血球計數(shù)板法[14]測定布朗葡萄藻藻液的細胞密度。最佳測定波長下測定不同細胞密度藻液的吸光值，繪制吸光值與細胞密度的標準曲線。

1.2.3 無機試劑絮凝效應測定

以沉降高度和沉降率表征絮凝效應，設不同濃度的硫酸鋁、硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂、氯化鐵和硫酸鐵溶液。藻液pH值為8的條件下，將6種無機絮凝劑分別添加到75 mL(容器半徑為1.3 cm，最高高度為14.4 cm)布朗葡萄藻藻液中進行絮凝試驗。藻液初始細胞密度為ρ0(萬個/mL)，初始藻液高度h0(cm)。在10、25、40、60、120 min時測量沉降后下層藻液高度h1(cm)，計算沉降高度h沉降(cm)；在40、60、120 min時記錄上清藻液OD680，根據(jù)1.2.2所繪標準曲線計算上清藻液細胞密度ρ1(萬個/mL)，計算其沉降率P沉降(%)；沉降高度和沉降率計算公式如下：

h沉降=h0-h1

(1)

P沉降=(ρ0-ρ1)/ρ0×100

(2)

2 結果與討論

2.1 布朗葡萄藻測定波長確定

圖1為不同細胞密度布朗葡萄藻藻液的光譜掃描結果。在試驗設定的不同波長中，所測得的不同細胞密度的藻液均在680 nm±5 nm處存在相對較大且平穩(wěn)吸收峰，與黃美玲[12]等報告的小球藻及沈萍萍[13]等報告的15種微藻的最佳測定波長相同，最佳測定波長與其色素種類組成及含量有關，說明布朗葡萄藻與大部分微藻含有相似的色素。為此，以OD680表征布朗葡萄藻的吸光值。

圖1 不同細胞密度布朗葡萄藻光譜掃描圖

2.2 680 nm條件下吸光值與細胞密度之間的關系

同一批不同細胞密度的布朗葡萄藻藻液，血球計數(shù)板計數(shù)法(n=5)測定細胞密度，采用光密度法，繪制吸光值與藻細胞密度之間的吸收曲線。圖2表明，在680 nm的波長下，吸光值與細胞密度線性相關度達R2=0.9918，可用OD680表征布朗葡萄藻的細胞密度。

圖2 680 nm波長下藻液吸光值與細胞密度標準曲線

2.3 無機絮凝劑絮凝效應

2.3.1 絮凝效應的表征及絮凝時間

實驗發(fā)現(xiàn)，沉降高度反映沉降后布朗葡萄藻藻液含水量，即富集度，沉降高度越高，富集度越好；沉降率反應沉降后布朗葡萄藻的得率，沉降率越高，得率越高；因此以沉降高度和沉降率綜合表征絮凝效應。同時布朗葡萄藻經(jīng)6種無機絮凝劑絮凝處理，60 min后沉降高度和沉降率趨于穩(wěn)定，以60 min絮凝處理后的沉降高度、沉降率表征6種無機試劑對布朗葡萄藻的絮凝效應。

2.3.2 鋁(Ⅲ)鹽絮凝效應

從圖3(a)中可以看出，隨著硫酸鋁添加量的增加，沉降高度呈現(xiàn)上升趨勢，但在60 min后并無顯著差異(P>0.05)。藻液在絮凝60 min后，不同濃度的硫酸鋁的沉降高度在11.88～12.24 cm之間(P>0.05)；從圖3(b)中可以看出，硫酸鋁對藻液的沉降率在絮凝60 min后趨于穩(wěn)定，不同濃度的硫酸鋁對藻液的沉降率有顯著差異(P<0.05)，當添加量為1.1 g/L時出現(xiàn)最大值為91.2%。

從圖4(a)絮凝結果可以看出，硫酸鋁銨的添加量在0.5～0.7 g/L時，不同濃度的硫酸鋁銨對沉降高度的影響并不顯著(P>0.05)。沉降60 min藻液穩(wěn)定后，硫酸鋁銨的添加量為1.1 g/L時，沉降高度出現(xiàn)最大值為12.42 cm。但是，當硫酸鋁銨濃度大于0.7 g/L時，藻體部分死亡變白，硫酸鋁銨濃度大于1.2 g/L時，藻體全部死亡。因此硫酸鋁銨的最適添加量應為0.5 g/L，絮凝60 min后沉降高度為12.06 cm，沉降率為83.2%(圖4b)。

不同濃度的硫酸鋁鉀對藻液的沉降高度及沉降率有顯著差異(P<0.05)，藻液的沉降高度和沉降率隨硫酸鋁鉀濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(圖5)。從圖中可以看出，沉降60 min后，沉降高度與沉降率趨于穩(wěn)定，此時藻液的沉降高度最大為12.06 cm(圖5a)，沉降率為93.5%(圖5b)。硫酸鋁鉀濃度大于0.5 g/L時，藻體部分死亡變白，因此硫酸鋁鉀的添加量應小于0.5 g/L。在添加量為0.45 g/L，沉降60 min后，藻液的沉降高度為10.08 cm，沉降率為93.5%。

3種鋁(Ⅲ)鹽對布朗葡萄藻的絮凝效應不同，是由于在pH值為8條件下3種鹽中的鋁離子強度的不同，離子強度越強，鋁離子對細胞壁上多糖的絡合力就越強，吸附效率越高，絮凝效應越好[15,16]；高濃度硫酸鋁銨對布朗葡萄藻之所以有致死作用，主要是銨離子對藻體有脅迫作用，抑制叢粒藻烯的合成，后期造成不可逆的毒害作用[17]；而硫酸鋁鉀其本身有一定毒性，需在食品和藻類中慎加，對布朗葡萄藻藻體的細胞壁有不可逆的毒害作用，易造成藻體死亡。

圖3 不同濃度硫酸鋁對布朗葡萄藻的絮凝效應

圖4 不同濃度硫酸鋁銨對布朗葡萄藻的絮凝效應

圖5 不同濃度硫酸鋁鉀對布朗葡萄藻的絮凝效應

2.3.3 鎂(Ⅱ)鹽絮凝效應

從圖6(a)中可以得出，隨著硫酸鎂添加量的增加，藻液沉降高度呈顯著的上升趨勢(P<0.05)，在絮凝時間高于60 min后，沉降高度趨于穩(wěn)定。對于沉降率(圖6b)，有相同的趨勢。但是，硫酸鎂濃度≥1.0 g/L時，藻體部分死亡變白，硫酸鎂濃度≥1.3 g/L時，藻體全部死亡。因此，硫酸鎂對藻液絮凝作用的最適添加量為0.8～0.9 g/L，沉降高度和沉降率分別為10.80 cm和81.0%。

高濃度的硫酸鎂溶液之所以對布朗葡萄藻有致死作用，主要是因為鎂離子對布朗葡萄藻有脅迫作用[18]，易引起布朗葡萄藻死亡變白。

圖6 不同濃度硫酸鎂對布朗葡萄藻的絮凝效應

2.3.4 鐵(Ⅲ)鹽絮凝效應

以硫酸鐵為絮凝劑對布朗葡萄藻的絮凝作用見圖7。從圖7(a)中可以看出，隨著添加量的增大，藻液的沉降高度呈顯著變化(P<0.05)。60 min后，硫酸鐵的添加量為1.2 g/L時，有最高的沉降高度為10.8 cm，此時藻液的沉降率為47.9%(圖7b)；對于藻液的沉降率，在整個絮凝過程中隨硫酸鐵的添加量的增加呈顯著的上升趨勢(P<0.05)，硫酸鐵的添加量為1.4 g/L時，其最大值為65%(圖7b)。

圖8為不同濃度的氯化鐵對布朗葡萄藻絮凝效應的影響。藻液的沉降高度隨絮凝時間增加顯著的上升(P<0.05)，在60 min后趨于穩(wěn)定(圖8a)；在絮凝劑的添加量高于0.7 g/L后，絮凝高度有明顯的上升過程；從氯化鐵對其絮凝結果中可以看出(圖8b)，絮凝劑的濃度對沉降率并無顯著作用(P>0.05)，并且在絮凝60 min后趨于穩(wěn)定。添加量為0.9 g/L時，藻液的沉降高度和沉降率達到最大值，分別為10.62 cm、88.0%。

兩種鐵(Ⅲ)對布朗葡萄藻絮凝效應的差異，主要是因為在堿性條件下兩種鐵鹽的離子強度：氯化鐵>硫酸鐵，氯化鐵更易與藻體形成絮凝而沉降[15，16]。

圖7 不同濃度硫酸鐵對布朗葡萄藻的絮凝效應

圖8 不同濃度氯化鐵對布朗葡萄藻的絮凝效應

3 結論

本研究采用光密度法測定布朗葡萄藻的生物量，確定了布朗葡萄藻的最佳測定波長為680 nm，得出了OD680與藻液細胞密度的相關性標準曲線，說明光密度測定生物量的可行性，以此間接測定布朗葡萄藻的絮凝效應。

根據(jù)絮凝單因素試驗，發(fā)現(xiàn)6種無機試劑對布朗葡萄藻均有明顯的絮凝效應，但硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂超過一定添加量會造成藻體死亡；同時發(fā)現(xiàn)硫酸鋁、硫酸鋁鉀、氯化鐵3種無機試劑的絮凝效果較其它3種無機試劑明顯；根據(jù)試驗得出：絮凝時間控制在60 min；硫酸鋁濃度控制在1.1 g/L，沉降高度為12.24 cm，沉降率為91.2%；硫酸鋁鉀濃度控制在0.45 g/L以內(nèi)，沉降高度為10.08 cm，沉降率為93.5%；氯化鐵濃度控制在0.9 g/L，沉降高度為10.62 cm，沉降率為88.0%。

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